一种批量冷冻石斑鱼精子的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鱼类繁殖与育种学领域，具体涉及一种批量快速保存石斑鱼精子的方 法。
【背景技术】
[0002] 鱼类精液超低温保存在水产养殖、遗传育种及种质资源保存中具有很重要意义： 鱼类精液的超低温冷冻保存，不仅可以实现种质材料的长距离运输，有利于不同区域鱼类 的杂交、选育、获得优良性状及基因多样性保护；还可以为水产养殖业和实验生物学研宄长 期稳定地提供材料。鱼类精子低温冷冻保存研宄开始于20世纪50年代初期。英国学者 Blaxter使用干冰直接冷冻保存太平洋鲱鱼（Clupea pallasi)精巢，获得80%的受精率。 之后，国内外学者们对鱼类精子冷冻保存开展了大量研宄。目前已建立200多种淡水鱼类 和40多种海水鱼类，包括花鲈、牙鲆、大菱鲆、大黄鱼、真鯛、四大家鱼、鲫鱼、鲤鱼、团头鲂、 大口鲇、鱖、舞鱼、石斑鱼及虹鳟等重要经济鱼类的精子超低温保存方法。
[0003] 低温生物学研宄表明，生物体的一切生化活动，虽大多数由酶所催化而表现多种 特殊形式，但仍然服从于共同的生物学规律。其共同的规律是，酶的催化活性是受温度影响 的，大多数酶都有其特定的最佳反应温度，但随着温度的降低，酶的活性逐渐下降，当温度 降到一定程度，各种酶都会失去活性，不能发挥催化作用，因此，生物体的所有生化活动基 本停止，进入一种低能耗、低新陈代谢的休眠状态。
[0004] 精子低温保存是一项需要控制非常精细的技术，处理条件应用得当时低温可以长 期保存精子；处理条件应用不当会严重损伤精子，一般使用液氮低温保存精子所产生的损 伤包括（1)渗透压损伤、（2)冰晶损伤、（3)冷休克损伤、（4)抗冷冻剂毒性、（5)pH损伤、 (6)复温过程的冷冻的逆过程。一般通过筛选合适的精子稀释剂和抗冻剂来减少冻存对精 子的伤害，而精子的低温冷冻步骤对于精子活性的保存也具有重要作用。采用合适的降温 速率是减少渗透压损伤和冰晶损伤的重要环节，是保证鱼类精子超低温冷冻保存成功的关 键之一。由于在鱼类精子冻存的研宄报道中，基本上是采用实验室条件下的单管或少量多 管保存，少量保存实验可以利用精密的程序降温设备快速摸索最佳冻存条件，然而这种少 量冻存程序却较难在渔业生产中得到大规模的应用。这是因为在单管条件下，精子样品本 身的散热较少，可以准确地遵循降温程序达到预定的温度条件。而在批量条件下，如果采用 单管冻存则非常费时费力；如果采用多管同时冻存，由于样品的散热较大，除非采用大型的 程序降温仪，否则通常不能达到预定的温度条件，从而导致精子在降温过程中损伤。鱼类人 工繁殖生产所需要的精子量较大，采用合适的包装方式和降温程序来批量保存精子才能满 足产业规模化生产的需要。
[0005] 石斑鱼在我国海水增养殖业中的重要经济地位，目前杂交石斑鱼是南方海水养殖 的重要发展方向，杂交石斑鱼技术需要用到较大量的异源精子，采用批量精子保存技术才 能够满足石斑鱼杂交生产的迫切需要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供了一种快速批量保存石斑鱼精子的方法，解决了现有石斑鱼 精子超低温保存方法效率较低、量小、操作复杂等问题。
[0007] 为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种批量冷冻石斑鱼精子的方法， 包括以下步骤：
[0008] 1)精子取材
[0009] 在石斑鱼进入繁殖盛期的第1、2周内选择健康成熟石斑鱼雄鱼进行采精，采精前 擦干鱼体并排除尿液和粪便，将乳白色浓度适中且精子活力旺盛的精样置于50ml EP管中 密封、闭光、冰浴保存；显微镜镜检激活观察，室温下80%精子在5min内保持运动状态为合 格样品；
[0010] 2)精子的稀释
[0011] 选取步骤1)的合格精子，采用常规Ts-2为精子稀释液，DMSO为抗冻剂，按照精子： 稀释液：DMSO = 4. 5:4. 5:1的体积比例均匀混合精子和试剂；
[0012] 3)样品的分装
[0013] 将混合好的精子样品分装到2. 5ml体积的冻存管中，每管Iml精子样品；将已分装 的冻存管装入样品保存盒中，冻存管放置的位置为单数标号位置，一个样品盒放置13管精 子样品；
[0014] 4)样品盒的安放
[0015] 将装盒的精子样品置于冰浴平衡30min ;将样品盒放入样品架从下往上的第1层、 3层、5层，样品相邻层之间的垂直间距为6cm ;
[0016] 5)降温操作
[0017] 将样品架第1层置于液氮面上方6cm处lOmin，然后将第1层降到液氮面放置 5min，然后将第1层浸入液氮中；此时正好保持第3层距离液氮面6cm放置5min，然后将第 3层降到液氮面放置5min，再将第3层完全浸入液氮中；此时第5层刚好距离液氮面6cm放 置5min，然后将第5层降到液氮面放置5min，最后将第5层完全浸入液氮中；
[0018] 6)复温操作
[0019] 将样品架整个取出，迅速将样品盒置于42°C水浴中，并充分在水浴中摇晃解冻，镜 检活力后使用。
[0020] 本发明具有以下优点：
[0021] 1)本发明保存石斑鱼精子的效率较高，采用分隔放置冻存管的方法有效避免相邻 样品管降温过程中散热对精子的损伤，大大提高多管冻存精子复温后的活力。
[0022] 2)本发明采用液氮样品架保存精子，相邻层样品垂直间距6cm，此设计一方面保 证每层精子样品都能按照三步法程序降温，一方面相邻层的样品受前一层样品液氮沸腾的 影响大大降低。
[0023] 3)本发明可以节约冷冻操作的时间，使用本发明方法35min即可完成39ml精子的 超低温冷冻操作，减少了人工操作的工作量。本方法单个液氮罐可冻存234ml的精子，可满 足20kg受精卵生产的需要，大大减少了精子冻存操作时间、储存和运输成本。
[0024] 4)本发明方法在于保证受精率的同时提供了保存工作的效率、提高单液氮罐保存 量。一次繁殖通常要生产几十公斤的受精卵，用常规方法的话起码要携带5-6个大液氮罐， 而且受精率低，用本发明方法1个液氮罐就可以满足一个繁殖周期的量。