一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用，本发明的达氏鲟精子冷冻保存液包括蔗糖，海藻糖，三羟基氨基甲烷，氯化钾，还原型谷胱甘肽，甲醇。本发明所述的达氏鲟精子冷冻保存液，成分简单，冷冻保存成本低。其中，还原型谷胱甘肽的加入，起到了很好的抗氧化作用，对精子质膜起到很好的保护作用，同时还降低了DNA分子损伤。海藻糖的加入，则具有防止蛋白质变性，有效保护精子的作用。利用本发明的精子冷冻保存液，解冻后精子活力高于70%，受精率达45%。
【专利说明】一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于低温冷冻生物学领域，具体涉及一种达氏鲟精液冷冻保存液，还涉及 一种达氏鲟精液冷冻保存液的制备方法，还涉及一种达氏鲟精液冷冻保存液的应用，该精 液冷冻保存液适合于达氏鲟。
【背景技术】
[0002] 鱼类精液超低温冷冻保存技术在鱼类遗传育种研究、鱼类养殖及种质资源保护等 方面具有重要的应用价值。鱼类精液超低温冷冻保存技术的研究是从上世纪50年代开始 的，国内外学者在淡水和海水经济鱼类以及濒危鱼类的精液冷冻保存技术方面做了大量的 工作。鲟鱼类精液冷冻保存技术的研究起步较晚，最初主要是俄罗斯鲟精液冷冻保存。随 后，匙吻鲟、西伯利亚鲟、闪光鲟等其它鲟鱼的精液超低温保存技术也得到了广泛的研究。 达氏鲟为我国国家一级保护动物，被世界自然保护联盟（IUCN)列为极危物种，濒危野生动 植物国际贸易公约（CITES)附录II保护动物。通过精液冷冻保存技术，将其现有种群的精 液，长期、有效地保存起来，即建立达氏鲟冷冻精子库，以后用解冻精子与卵子进行人工授 精，就可以将达氏鲟的基因资源完全保存下来，为该物种种质资源保护开辟了一条新的途 径。
[0003] 保存精子的方法很多，主要有低温、常温和冷冻三种。低温和常温用于短期保存精 液，而冷冻或超低温冷冻则可以长期保存精液。目前，国内外广泛采用冷冻技术保存精液， 常用的抗冻剂有干冰（液态二氧化碳，沸点一 79°c )和液氮（沸点一 196°C )等，用液氮保 存精液，精子的代谢停滞，精子处于假死状态，但其结构却能保持完整。因此，如何使精子不 受影响地以完整结构达到超低温状态，就成为精液超低温保存技术的一项关键问题。
[0004] 冷冻保存液的配制是鱼类精液冷冻保存中的关键一环。冷冻保存液是由一定组成 成分和配比浓度的稀释液以及一定浓度的抗冻剂组成的，冷冻保存液的适合与否直接影响 保存的效果。鱼的种类不同，精子的生理特性也有差异，因而对稀释液和抗冻剂的组成成份 和浓度具有不同的要求。鱼类精液冷冻保存稀释液成份很多，主要有盐类（如NaHC0 3、NaCl、 KC1、KHC03、柠檬酸钠等）、糖类（如葡萄糖、果糖、蔗糖等）、脂类（主要是磷脂）和蛋白质 (如卵黄、牛奶、小牛血清等）、以及其他添加剂（如甘氨酸、抗生素）等。对于鲟鱼的精子 来说，稀释液的渗透压要等于或高于精子的渗透压，这样精子被稀释后不会被激活。稀释液 的渗透压等同于各组成成分离子浓度之和。这里我们还要注意K离子对鲟鱼精子的抑制作 用，无论稀释液的渗透压有多低，只要K离子的浓度高于2mM，精子的运动会被完全抑制，所 以K离子在鲟鱼精子稀释液中浓度不可太高，否则会造成不可逆抑制。而糖类等大分子类 溶质除了起到调节渗透压的作用外，还具有提供精子能量的作用。脂类和蛋白质以及其他 添加剂主要对精子某个部位或某个方面起到保护的作用。常用的抗冻剂有甘油、二甲亚砜、 乙二醇、乙酰胺、丙二醇、甲醇等。这类抗冻剂多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分 子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护精子的目的。
[0005] -般情况下，精子经冷冻保存后其活力和受精能力均会显著下降，其中部分原因 取决于膜结构的完整性遭到破坏。大量研究证明精子在冷冻保存过程中会产生氧的自由基 或者改变抗氧化酶的活性，从而引起膜脂的过氧化反应、导致膜脂结构和精子渗透压的改 变，或直接攻击精子DNA碱基等，最终导致精子生存能力的降低。
[0006] 因此，在冷冻保存液的配制过程中，针对某物种的精液，我们不仅要考虑离子及其 浓度、糖类组成及浓度以及缓冲液的pH值等，还要思考能否通过添加剂来改善冷冻保存的 条件，如抗氧化剂等，从而提1?冷冻保存的效果。本发明旨在达氏鲜精子冷冻保存研究尚存 空白的情况下，发明一种达氏鲟精子冷冻保存液能够有效的长期保存达氏鲟的精子，并可 极大的保护精子免受冰晶及氧化等损伤。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供了一种达氏鲟精子冷冻保存液，该保存液由蔗糖，海藻糖， 三羟甲基氨基甲烷，氯化钾，还原型谷胱甘肽及甲醇按照一定配比混合而成，在达氏鲟精子 超低温冷冻保存过程中，可极大的保护精子免受冰晶及氧化等损伤。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供了一种达氏鲟精子冷冻保存液的制备方法，方法简 单，易行，适于大规模生产，该方法适合配制各种体积的稀释液，可确保所配制稀释液中个 组分浓度的准确性。
[0009] 本发明的最后一个目的在于提供了一种达氏鲟精子冷冻保存液在达氏鲟精子冷 冻保存中的应用，该应用包括利用本发明的达氏鲟精子冷冻保存液进行达氏鲟的精子冷冻 保存，还包括利用本发明的配方制备达氏鲟精子冷冻保存液。
[0010] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0011] 一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：
[0012] 庶糖 30-90mmol 海藻糖 15-45mm〇[ 二羟鴨氣卿烷 2040圆01 Si 化钾 0.5-2mmol
[0013] 还原型騰"Hltfc 3.2-9.8 mmol if If： 0.08-0.2L
[0014] 其余为去离子水
[0015] 加入甲醇之前的溶液渗透压为69. 2-188. 8m0sM，冷冻保存液的pH为7. 4-8. 6。
[0016] 一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：
[0017] 蘼糖 40-S0mmol 海藻糖 2CMI0mmol 三醫黨mmwm 22.5-37,5mmol M化卿 0J5-i.5mmol a原 fmitii·歌 5-8mmoI Ψ靜 0.085-0.15L
[0018] 其余为去离子水
[0019] 加入甲醇之前的溶液渗透压为89-168. 5m0sM，冷冻保存液的pH为7. 6-8. 4。
[0020] -种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：
[0021] 蔗糖 50-70mmoi Wii糖 2S-35mmof 五?￥基氧基￥垸 25-35rnmol 氣化钾 0.8-1.3 mmol 还原壞谷 ttlitt 5S-?5mmol f If 0,09-0.131
[0022] 其余为去离子水
[0023] 加入甲醇之前的溶液渗透压为107. 1-150. ImOsM，冷冻保存液的pH为7. 8-8. 2。
[0024] -种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：
[0025] ft!;H 55-65mmoi 賴_ 27.5^32.5mmoi 二羟丨1-?-堪 ?-堪 <tf 烷 2S-35mmol 氣化钾 0.9-1.Irnmoi 还hTK 6-7mmoI 甲 If 0.095-0.11L
[0026] 其余为去离子水
[0027] 加入甲醇之前的溶液渗透压为117. 8-139. 2m0sM，冷冻保存液的pH为7. 9-8. 1。
[0028] -种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液（最佳配比）中包含：
[0029] 蔗糠 60mmo! 海藻糖 30mmol -；Κ>ιΙ!%Μ%Ψ? 30mmol 籯化娜 Immoi 还原m聽甘肽 6B4mmol _ O.IL
[0030] 其余为去离子水
[0031] 加入甲醇之前的溶液渗透压为128. 4m0sM，冷冻保存液的pH为8. 0。
[0032] -种达氏鲟精子冷冻保存液的制备方法，其步骤如下：
[0033] 1)根据总精液量计算需要冷冻保存液的总体积。
[0034] 2)根据冷冻保存液的总体积和各组分的配方浓度以及各组分贮备液的浓度，计算 各组分贮备液的量取体积，计算公式为：各组分量取体积=各组分的配方浓度X冷冻保存 液总体积+各组分贮备液的浓度，用微量取样器从各组分贮备液中量取相应的体积并混 匀，最后加蒸馏水至冷冻保存液的终体积。
[0035] 3)从上述溶液中量取出冷冻保存液总体积X甲醇浓度的体积溶液，再加入等量 的甲醇混匀配制成最终的精子冷冻保存液。配制好的冷冻保存液应立刻用于精子的超低温 冷冻保存。
[0036] -种达氏鲟精子冷冻保存液在达氏鲟精子冷冻保存中的应用，其应用过程如下：
[0037] 1)、精液采集与检测
[0038] 待达氏鲟繁殖季节，对雄性亲鱼进行B超检查性腺发育状况，对达到性成熟的亲 鱼进行人工催产，采集精液时，用干毛巾擦净亲鱼生殖孔周围，挤压腹部，收集无粪便和杂 物的干净精液于塑料袋中，充氧后密封并于4°C存放。利用显微镜检测精子活力，成活率在 90%以上的精液用于冷冻保存。
[0039] 2)、精液的稀释、分装和冷冻
[0040] 取l〇〇ml精液，加入100ml新鲜配制的冷冻保存液，稀释比为1:1。精液与冷冻液 混匀后，立刻分装至2ml冷冻管中。同时程序降温仪开启，预冷至0°C。
[0041] 程序降温：从 0°C 开始，3°C /min 降至 _5°C，5°C /min 降至-15°C ;10°C /min 降 至-25°C ;20°C /min降至-80°C，在_80°C平衡5min后，直接将冷冻管从程序降温仪中取出， 立即放入液氮（_196°C )中保存。
[0042] 3)、解冻和精子活力检测
[0043] 将装有精子的冷冻管从液氮中取出，立即浸入40°C水浴中，一边摇动一边解冻，至 完全融化为止。
[0044] 在载波片上滴加30 μ 1蒸馏水，然后用针尖蘸取少许精液，迅速涂在蒸馏水中，并 利用显微镜观察精子激活后的运动状况，精子活力达70%以上，运动时间持续3-4min。
[0045] 4)、解冻后精子用于授精
[0046] 将采集的成熟卵置于洁净、干燥的容器中，再将解冻后的精液加入卵中（精子与 卵子的比值约为3 X 105)，用手轻轻搅动，使精卵充分混匀，然后加水，激活精子使其与卵子 受精，轻轻搅拌后，倒掉上方的污水，将卵移入孵化器中孵化。
[0047] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0048] 1、实现了达氏鲟精子冷冻保存和应用，该方法可以应用于人工繁殖中解决精液量 不足的问题，又可以实现达氏鲟种质资源永久保存的目的。
[0049] 2、精子冷冻保存液成分简单，冷冻保存成本低。
[0050] 3、冷冻保存液中加入了还原型谷胱甘肽，起到了很好的抗氧化作用，对精子质膜 起到很好的保护作用，同时还降低了 DNA分子损伤。
[0051] 4、冷冻保存液中海藻糖的加入，具有防止蛋白质变性，有效保护精子的作用。
[0052] 5、解冻后精子活力高于70% (新鲜采集精子活力高于90%)，受精率达45% (新 鲜采集精子受精率为60-70% )。
【具体实施方式】
[0053] 本发明实施例中的技术方案，如未特别说明，均为常规技术，所用试剂如未特别说 明，均购自生化商店。
[0054] 实施例 1-9 :
[0055] 蔗糖、海藻糖、三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、还原型谷胱甘肽、无水乙醇、以及去离 子水。以上试剂原料均购置于Sigma公司。
[0056] 储存液的配制：
[0057] 1) 1M浓度的蔗糖贮备液：蔗糖分子量342,配制体积100ml的溶液需要蔗糖的重量 为34. 2g，将称取的蔗糖放入烧杯中，先加入60ml的蒸馏水，用玻璃棒搅拌使其充分溶解， 再将溶液定容至l〇〇ml。
[0058] 2) 1M浓度的海藻糖贮备液：海藻糖分子量342,配制体积10ml的溶液需要海藻糖 的重量为3. 42g，将称取的海藻糖放入10ml的离心管中，先加入6ml的蒸馏水，旋紧离心管 的盖子，上下摇动离心管使海藻糖充分的溶解，再将溶液定容至l〇ml。
[0059] 3)0. 1M浓度的三羟甲基氨基甲烷贮备液：三羟甲基氨基甲烷分子量121，配制体 积l〇〇ml的溶液需要三羟甲基氨基甲烷的重量为1. 21g，将称取的三羟甲基氨基甲烷放入 烧杯中，先加入80ml的蒸馏水，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，再用盐酸溶液调节pH，范围为 7. 4-8. 6,最后将溶液定容至100ml。
[0060] 4) 0. 1M浓度的氯化钾贮备液：氯化钾分子量74. 55,配制体积50ml的溶液需要氯 化钾的重量为0. 373g，将称取的氯化钾放入50ml的离心管中，先加入40ml的蒸馏水，旋紧 离心管的盖子，上下摇动离心管使氯化钾充分的溶解，再将溶液定容至50ml。
[0061] 5)0.32M浓度还原型谷胱甘肽贮备液：还原型谷胱甘肽分子量307.32,配制体 积lml的溶液需要还原型谷胱甘肽的重量为0. lg，将称取的还原型谷胱甘肽放入lml的离 心管中，先加入〇. 5ml的蒸馏水，盖紧离心管，上下摇动离心管使还原型谷胱甘肽充分的溶 解，再将溶液定容至lml。
[0062] 上述贮备液均须配制新鲜的溶液，可暂时放置4°C冰箱保存。
[0063] 一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：
[0064]
【权利要求】
1. 一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含： 鹿糖 30_90mmol 海藻糖 15_45mmol 三轻甲基氨基甲烧 20-40mmol 氯化钾 0. 5_2mmol 还原型谷胱甘肽 3. 2-9. 8mmol 甲醇 0. 08-0. 2L 其余为去离子水 加入甲醇之前的溶液渗透压为69. 2-188. 8mOsM，冷冻保存液的pH为7. 4-8. 6。
2. -种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含： 鹿糖 40_80mmol 海藻糖 20_40mmol 三羟甲基氨基甲烷 22. 5-37. 5mmol 氯化钾 0· 75-1. 5mmol 还原型谷胱甘肽 5-8mmol 甲醇 0· 085-0. 15L 其余为去离子水 加入甲醇之前的溶液渗透压为89-168. 5mOsM，冷冻保存液的pH为7. 6-8. 4。
3. -种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含： 鹿糖 50_70mmol 海藻糖 25_35mmol 三轻甲基氨基甲烧 25-35mmol 氯化钾 0. 8-1. 3mmol 还原型谷胱甘肽 5. 5-7. 5mmol 甲醇 0· 09-0. 13L 其余为去离子水 加入甲醇之前的溶液渗透压为107. 1-150. ImOsM，冷冻保存液的pH为7. 8-8. 2。
4. 一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含： 鹿糖 55-65mmol 海藻糖 27. 5-32. 5_〇1 三轻甲基氨基甲烧 25-35mmol 氯化钾 0. 9-1. lmmol 还原型谷胱甘肽 6_7mmol 甲醇 0· 095-0. 11L 其余为去离子水 加入甲醇之前的溶液渗透压为117. 8-139. 2m0sM，冷冻保存液的pH为7. 9-8. 1。
5. -种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含： 鹿糖 60mmol 海藻糖 30mmol 三轻甲基氨基甲烧 30mmol 氯化钾 lmmol 还原型谷胱甘肽 6. 4mmol 甲醇 0. 1L 其余为去离子水 加入甲醇之前的溶液渗透压为128. 4m0sM，冷冻保存液的pH为8. 0。
6. 权利要求1所述的一种达氏鲟精子冷冻保存液的制备方法，其步骤如下： 1) 根据总精液量计算需要冷冻保存液的总体积； 2) 根据冷冻保存液的总体积和各组分的配方浓度以及各组分贮备液的浓度，计算各组 分贮备液的量取体积，计算公式为：各组分量取体积=各组分的配方浓度X冷冻保存液总 体积+各组分贮备液的浓度，用微量取样器从各组分贮备液中量取相应的体积并混匀，最 后加蒸馏水至冷冻保存液的终体积； 3) 从上述溶液中量取出冷冻保存液总体积X甲醇浓度的体积溶液，再加入等量的甲 醇混匀配制成最终的精子冷冻保存液。
7. 权利要求1所述的一种达氏鲟精子冷冻保存液在达氏鲟精子冷冻保存中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其应用过程具体如下： 1) 、精液米集与检测 待达氏鲟繁殖季节，对雄性亲鱼进行B超检查性腺发育状况，对达到性成熟的亲鱼进 行人工催产，采集精液时，用干毛巾擦净亲鱼生殖孔周围，挤压腹部，收集无粪便和杂物的 干净精液于塑料袋中，充氧后密封并于4°C存放； 利用显微镜检测精子活力，成活率在90%以上的精液用于冷冻保存； 2) 、精液的稀释、分装和冷冻 取100ml精液，加入100ml新鲜配制的冷冻保存液，稀释比为1:1 ;精液与冷冻液混匀 后，立刻分装至2ml冷冻管中； 同时程序降温仪开启，预冷至〇°C ; 程序降温：从 〇°C开始，3°C /min 降至 _5°C，5°C /min 降至-15°C;10°C /min 降至-25°C; 20°C/min降至-80°C，在_80°C平衡5min后，直接将冷冻管从程序降温仪中取出，立即放入 液氣中保存； 3) 、解冻和精子活力检测 将装有精子的冷冻管从液氮中取出，立即浸入40°C水浴中，一边摇动一边解冻，至完全 融化为止； 在载波片上滴加3〇μ1蒸馏水，然后用针尖蘸取少许精液，迅速涂在蒸馏水中，并利用 显微镜观察精子激活后的运动状况，精子活力达70%以上，运动时间持续3-4min ; 4) 、解冻后精子用于授精 将采集的成熟卵置于洁净、干燥的容器中，再将解冻后的精液加入卵中，精子与卵子的 比值约为3X 105,用手轻轻搅动，使精卵充分混匀，然后加水，激活精子使其与卵子受精，轻 轻搅拌后，倒掉上方的污水，将卵移入孵化器中孵化。
【文档编号】A01N1/02GK104054697SQ201410318701
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月7日 优先权日:2014年7月7日
【发明者】厉萍, 危起伟, 席萌丹, 柳凌, 郭威, 乔新美 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所