水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1及应用的制作方法
【专利摘要】一种水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1及应用。该水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYB1R1是具有下述核苷酸序列之一：(a)序列表中SEQ?ID?No:1的DNA序列；(b)编码序列表中SEQ?ID?No:2蛋白序列的多核苷酸。在水稻在干扰表达该基因，可以提高水稻对耐干旱胁迫和/或耐高盐胁迫的抗性。利用本发明的水稻MYB转录因子基因OsMYB1R1可培育出耐干旱胁迫和/或耐高盐胁迫的水稻品种。
【专利说明】水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYBI R1及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程【技术领域】，具体涉及一种水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYBlRl的分离克隆、功能验证和应用。
【背景技术】
[0002]水稻作为一种重要的农作物，是世界半数以上人口的主食。水稻在整个生长周期里都难以避免各种恶劣外界环境的影响。其中各种非生物逆境诸如干旱和高盐胁迫影响水稻的生长发育，导致水稻产量和品质受到严重的影响。对水稻非生物逆境响应相关基因及其作用机理，以及非生物逆境响应信号网络的研究有助于了解植物对非生物逆境的响应机制，并指导进行水稻等粮食作物的遗传改良，保证粮食作物的稳产高产。为培育耐逆水稻新品系，人们通过利用基因工程手段和生物学技术研究水稻非生物胁迫应答过程中关键的调苄基因和重要的功能基因来提高植物的抗逆性。
[0003]MYB转录因子家族是一类数量庞大，通过植物体内多种信号网络参与各种生理生化反应的基因家族。已有研究表明，MYB转录因子基因主要在植物的发育、次级代谢产物的合成、植物激素信号转导中起着重要的作用。同时，MYB转录因子是也是众多参与逆境响应的转录因子家族中的一员，已经被研究发现参与了多种非生物逆境的响应。鉴于目前水稻中对MYB转录因子的 研究相对匮乏，对水稻MYB转录因子基因的功能发掘与开发利用将对培育新型抗逆水稻品种，提高水稻产量具有重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYBlRl及其编码蛋白，以用于提高水稻的抗逆性能。
[0005]本发明所提供的水稻耐逆性相关MYB转录因子基因，名称为OsMYBlRl，来源于水稻粳稻品种日本晴(Oryza sativa ssp.japonica),该基因在水稻基因组数据库TIGR中的编号为L0C_0s04g49450，编码一个含MYB相似结构域的MYB转录因子，该基因的⑶S全长1392bp，编码463aa的蛋白。到目前还没有任何关于OsMYBlRl基因功能的研究报道。本发明所述基因是具有下列核苷酸序列之一:
[0006]I)序列表 SEQ ID No: I 的 DNA 序列；
[0007]2)编码序列表中SEQ ID No:2蛋白质序列的多核苷酸。
[0008]序列表中SEQ ID No: I的DNA序列由2016个碱基组成，该序列编码SEQ ID No:3的核苷酸序列。
[0009]含有本发明OsMYBlRl基因的表达载体、转基因细胞系及寄主菌均属于本发明的保护范围。
[0010]本发明还提供一种培育植物非生物逆境抗性的方法，该方法是将所述的耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYBlRl构建RNAi干扰载体导入植物细胞或组织，以培育得到抗逆性(耐干旱和/或耐高盐)改良的植株。用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。利用任意一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的OsMYBlRl基因在植物中干扰表达表现出耐逆特征。
[0011]携带有本发明OsMYBlRl基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射以及电穿孔等常规生物技术方法转入植物细胞或组织，并培育出对非生物逆境如干旱、盐等耐受力增强的转基因植物。被转化的植物寄主可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也适用于烟草、大豆等双子叶植。
[0012]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为OsMYBlRl超量表达载体示意图。
[0014]图2为OsMYBlRlRNAi干扰表达载体示意图。
[0015]图3为OsMYBlRl转基因水稻的RT-PCR检测。
[0016]其中:A为 OsMYBlRl 超量表达株系 0E_4、0E_5 的 RT-PCR 检测；B 为 OsMYBlRlRNAi干扰表达株系 RNA1-1、RNA1-2、RNA1-5 及 RNAi_8 的 RT-PCR 检测。
[0017]图4为干旱逆境下OsMYBlRl超量表达水稻幼苗0E_4、0E_5及RNAi干扰水稻幼苗RNA1-U RNA1-8的生长状况。
[0018]其中:A为干旱处理前；B为干旱处理后；C为干旱处理并复水后；皆以野生型日本晴作为对照。
[0019]图5为高盐(175mmol/L NaCl溶液)逆境下OsMYBlRl过表达水稻幼苗OE和RNAi干扰水稻幼苗的生长状况。
[0020]其中:A为高盐处理前；B为高盐处理后；C为高盐处理并复水后；皆以野生型日本晴作为对照。
[0021]图6为不同浓度甘露醇(mannitol)处理后OsMYBlRl超量表达和RNAi干扰水稻幼苗的生长状况。
[0022]其中:A为I周龄幼苗在含不同浓度甘露醇的培养基上的生长情况；B为I周龄幼苗在含不同浓度甘露醇的培养基上生长7天后苗高的统计结果；C为I周龄幼苗在含不同浓度甘露醇的培养基上生长7天后根长的统计结果。
[0023]图7为孕穗期OsMYBlRl超量表达和RNAi干扰水稻植株干旱处理实验。
[0024]其中:A、B、C分别为孕穗期的WT日本晴对照和OsMYBlRl超量表达水稻植株OE在干旱处理前、干旱处理后以及干旱处理并复水后的水稻植株生长状态；
[0025]D、E、F分别为孕穗期的日本晴对照WT和OsMYBlRlRNAi干扰水稻植株在干旱处理前、干旱处理后以及干旱处理并复水后的水稻植株生长状态。
[0026]图8为孕穗期OsMYBlRl超量表达和RNAi干扰水稻植株在干旱处理后的各种生理生化指标的分析。
[0027]其中:A表不MDA含量；B表不脯氨酸含量；C表不相对电导率。
【具体实施方式】
[0028]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 [0029]实施例1、OsMYBlRl基因超表达植株的获得[0030]为了能更好地阐明OsMYBlRl基因的功能， 申请人:将其在水稻中超量表达和干扰表达，从转基因植株的表型来进行OsMYBlRl基因的功能验证。
[0031]一、水稻MYB转录因子编码基因基因OsMYBlRl的获得
[0032]本发明的水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYBlRl基因是从微陈列(Microarray)分析的结果发现的一个受干旱诱导的基因(0s04g49450),利用BLAST程序发现它与拟南芥中MYB转录因子基因具有同源性，于是命名为OsMYBlRl。根据水稻基因组数据库已公布的 0s04g49450 序列，设计引物(Pl，5’ -CGGGATCCTCGATTCAAGTCTGGAGATGG-3’ (如 SEQ ID N0.4 所示)，斜体碱基为 BamHI 酶切位点；P2，5’_GCTCTAGAGCAAGCATCTATAGTTGCAGTGAT-3’(如SEQ ID N0.5所示)，斜体碱基为XbaI酶切位点)扩增OsMYBlRl基因的蛋白编码区(SEQ ID N0.3)，用于进一步研究。提取两周苗龄的野生型水稻日本晴的幼苗总RNA反转录得到第一链cDNA。以第一链cDNA为模板，用Pl和P2进行PCR扩增。克隆PCR反应条件为:94°C预变性 3min ；94°C 30sec,60°C 30sec ；72°C lmin，28 个循环；72°C延伸 lOmin。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段。将该回收片段与载体pGEM-T Easy连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，根据pGEM_T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到了OsMYBlRl基因的蛋白编码区，OsMYBlRl基因的蛋白编码区序列如SEQ IDN0.3所示，由1392个脱氧核糖核苷酸组成，编码SEQ ID N0.2所示的蛋白。
[0033]二、OsMYBlRl基因超量表达载体的构建
[0034]1.用限制性内切酶BamH I和Xba I双酶切含CAMV35S启动子pCAMBIA-1301_multi载体和以引物 Pl:5’ -CGGG ATCCTCGATTCAAGTCTGGAGATGG-3’ (如 SEQ ID N0.6 所示)和 P2:5’ -GCTCTAGAGCAAGCATCTATAGTTGCAGTGAT-3’ (如 SEQ ID N0.7 所示)(含有 BamH I 识别位点GGATCC和Xba I识别位点TCTAGA)进行PCR扩增得到的OsMYBlRl基因，用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在LB平板上筛选具有卡那霉素抗性的菌落，提取质粒进行双酶切鉴定得到阳性植物表达载体，结果如图1所示。
[0035]三、OsMYBlRl基因RNAi干扰载体的构建
[0036]从质粒pBI121 上以引物 5’ -ATGGATCCGATATCTACCCGCTTCGCGTCG-3’ (如 SEQ IDN0.8 所示)和 5’-GGGAATTCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3’ (如 SEQ ID N0.9 所示)扩增约 500bp⑶S片段连接在pBluescript II SK(-)上构建一个中间载体pB⑶S，再以引物5’_CGGGATCCTGCAMCTGTGGCAGACATG-3’(如 SEQ ID N0.10 所示)和 5 ’-GCCCTCGAGCATTTCATCTTCGTTTCTGTTTCC-3’(如SEQ ID N0.11所示)进行RNAi片段的扩增，电泳检测，DNA纯化回收后的RNAi片段以正向和反向分别连接在中间载体PB⑶S的⑶S片段的两端,最后将Antisense-GUS-sense作为一个整体切下并连接到P1300M构建成RNAi载体。结果如图2所示。
[0037]四、OsMYBlRl基因转基因水稻的获得
[0038]将OsMYBlRl过表达和RNAi干扰载体用热激转化的方法分别转入农杆菌菌株EHA105中。用含OsMYBlRl过表达和RNAi干扰载体的农杆菌分别转化水稻品种“日本晴”，经过预培养、浸染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗、移栽，得到转基因植株。具体转化方法如下:
[0039]1.将健康成熟的“日本晴”水稻种子去壳后用75%的乙醇消毒lmin，倒掉乙醇后用0.1 %的HgC12灭菌15-30min，用无菌水洗涤3_4次，并用无菌吸水纸吸干水分。将种子接种于NB (或N6)愈伤组织诱导培养基(含3.0mg/L2，4-D)上，32°C光照培养7_10d。将愈伤组织转入继代培养基NB (或N6)中继代4d进行共培养。
[0040]2.从_80°C的超低温冰箱中取出含有目的植物表达载体的农杆菌菌种EHA105，在含50mg/L利福平(Rif)和50mg/L卡那霉素(Kan)的AB固体培养基上划线，28°C暗培养2-3d至长出菌落。浸染时从AB固体培养基上刮取适量菌体，用AAM液体培养基(含100 μ mol/L乙酰丁香酮，50mg/L Rif和50mg/L Kan)稀释菌体浓度至OD6tltl ^ 0.1左右。选取生长旺盛的米黄色胚性愈伤组织在菌液中浸染5min，期间不时摇动。将浸染后的愈伤组织转移到铺有无菌滤纸的N6-AS (含100 μ mol/L乙酰丁香酮)共培培养基上，于25°C暗培养 2-3d。
[0041]3.共培养后的愈伤组织用无菌水洗涤至水清澈，期间应轻柔的摇动。最后一次用含400mg/L头孢霉素和400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡愈伤组织30min后置于无菌吸水纸上吸去表面水分。
[0042]4.愈伤组织转移至选择培养基上，于超净工作台内吹l_2h后置于32°C光照培养箱中持续光照培养2-3周。待抗性愈伤组织长出后，将其转移至预分化培养基上，25°C暗培养2-3周；若愈伤质量好，预分化步骤可省，直接转移至分化培养基中。
[0043]5.从预分化培养基中转移白色紧实的愈伤组织至分化培养基上，于温室中每天14h光照培养，2-3周后可见愈伤组织上长出绿点，并逐渐长出绿芽；将分化出的小苗转移至生根培养基上培养两周。
[0044]6.待水稻小苗长至三角瓶顶部时，打开封口膜，炼苗3-5d，移出培养瓶，至室外盆栽。待生长一段时间后移至大田种植。
[0045]其中，水稻转化涉及的培养基如表1所示:
[0046]表1水稻转化涉及的培养基
[0047]
【权利要求】
1.一种水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYBIRI在提高水稻耐干旱和/或耐高盐抗性中的应用，该基因的DNA序列如序列表SEQ ID No:1所示。
2.一种水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYBlRl在提高水稻耐干旱和/或耐高盐抗性中的应用，该基因编码的蛋白序列如序列表SEQ ID No:2所示。
3.一种培育耐干旱和/耐高盐水稻的方法，其特征在于，该方法是将水稻耐逆性相关MYB转录因子基因OsMYBlRl构建RNAi干扰载体导入水稻细胞或组织，再将被转化的水稻细胞或组织培育成水稻，通过基因表达分析筛选干扰表达水稻，得到耐干旱和/或耐高盐水稻。
【文档编号】A01H5/00GK104031924SQ201410318680
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年7月7日 优先权日:2014年7月7日
【发明者】陈信波, 周小云, 彭艳, 唐宁, 刘爱玲, 张先文, 邹杰, 罗光宇 申请人:湖南农业大学