豹纹鳃棘鲈精子冷冻保护液及其保存方法
【专利摘要】本发明公开一种豹纹鳃棘鲈精子冷冻保护液，由以下组分配制而成：海藻糖34.23克，胎牛血清0.9升，超纯水定容至1升；所述冷冻保护液PH为7.45，渗透压为324mOsmol/Kg。在2ml冻存管中将精液与所述冷冻保护液等体积混合，然后在液氮面上5cm处停留3分钟后直接投入液氮中保存；解冻时，将冷冻在液氮中存有精子的冻存管取出，37℃水浴中1分钟。本发明与现有技术相比，具有以下的优点：对精子的毒性很低，且能提供精子所需营养物质。
【专利说明】豹纹鳃棘鲈精子冷冻保护液及其保存方法
[0001]
【技术领域】
本发明涉及鳃棘鲈属鱼类精子的冷冻保存，特别是对豹纹鳃棘鲈精子冷冻保护液及其保存方法。
[0002]
【背景技术】
鳃棘鲈是驰名世界的名贵海产鱼类，肉质鲜美，营养丰富，经济价值很高。鳃棘鲈属其中的一些种类(如豹纹鳃棘鲈)的人工养殖在我国广东和海南等省迅速普及和推广，成为南方沿海重要海水养殖种类。
[0003]超低温冷冻保存精液是保护鱼类优良种质的有效途径，我国鱼类精子冷冻保存的工作主要集中在“四大家鱼”等淡水鱼类以及鲆鲽类和大黄鱼等冷水性海水鱼类。不同种鱼类的精子生理特性等差异很大，因此超低温冷冻保存的最佳条件也千差万别。迄今，尚未见鳃棘鲈属鱼类精子超低温冷冻保存的研究报道。
[0004]冷冻保护液对精子保存效果至为关键，目前主要是采用渗透性抗冻剂(二甲亚砜、二甲基甲酰胺、甘油、甲醇、乙二醇等)与盐溶液(NaC 1、KC1、Na2CO3、NaH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、MgCl2等)混合配制。然而，渗透性抗冻剂大多为无机化学药品，本身对精子有一定的毒性；盐溶液也不能给精子提供必要的营养物质。
[0005]
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种豹纹鳃棘鲈精子冷冻保护液，解决目前采用的渗透性抗冻剂混合盐溶液存在的毒性及缺乏营养等问题。
[0006]本发明另一个目的在于提供一种上述豹纹鳃棘鲈精子冷冻保存方法，弥补目前鳃棘鲈属鱼类尚无相关保存技术的不足。
[0007]本发明解决技术问题的技术方案:一种豹纹鳃棘鲈精子冷冻保护液，由以下组分配制而成:海藻糖34.23克，胎牛血清0.9升，超纯水定容至I升；所述冷冻保护液PH为7.45，渗透压为 324m0smol/Kg。
[0008]本发明豹纹鳃棘鲈精子冷冻保存方法，在2ml冻存管中将精液与所述冷冻保护液等体积混合，然后在液氮面上5cm处停留3分钟后直接投入液氮中保存；解冻时，将冷冻在液氮中存有精子的冻存管取出，37°C水浴中I分钟。
[0009]本发明与现有技术相比，具有以下的优点:对精子的毒性很低，且能提供精子所需营养物质。
[0010]现有技术中的精子抗冻保护液的各种成分都可能对精子有一定的毒性，本发明将配方简单化，有利于减轻抗冻保护液本身对精子的不良影响。海藻糖是一种非渗透性的抗冻剂，能使精子脱水减少冷冻过程中产生冰晶损伤，从而起到保护精子的作用。海藻糖为大分子物质，不能穿过细胞膜进入到精子内部，相对于渗透性抗冻剂，海藻糖的毒性更低。胎牛血清是细胞培养的重要培养液之一，含有丰富的氨基酸和维生素，为精子提供丰富的营养物质。
【具体实施方式】
[0011]实施例1
1.冷冻保护液的配制:海藻糖34.23克，胎牛血清0.9升，超纯水定容至I升(PH=7.45,渗透压=324m0smol/Kg)。
[0012]2.采精:用丁香酚麻醉豹纹鳃棘鲈性成熟雄鱼，擦干鱼体避免精子与海水接触，轻压腹部收集精液于2ml冻存管中。
[0013]3.冷冻:在冻存管中将精液与冷冻保护液等体积混合，然后在液氮面上5cm处停留3分钟后直接投入液氣中保存。
[0014]4.解冻:将冷冻在液氮中存有精子的冻存管取出，37°C水浴中I分钟。
[0015]5.精子活力检测:利用计数机辅助精子分析系统检测豹纹鳃棘鲈精子解冻后的活力为36.33%，接近鲜精活力41.69%。
[0016]相同条件和操作下，三种渗透性抗冻剂二甲亚砜、二甲基甲酰胺和甘油保存精子的活力在20% — 30%之间，保存效果均低于本发明采用的抗冻保护液。
【权利要求】
1.豹纹鳃棘鲈精子冷冻保护液，其特征在于:海藻糖34.23克，胎牛血清0.9升，超纯水定容至I升；所述冷冻保护液PH值为7.45，渗透压为324mOsmol/Kg。
2.一种使用权利要求1所述冷冻保护液的豹纹鳃棘鲈精子冷冻保存方法，其特征在于:在2ml冻存管中将精液与所述冷冻保护液等体积混合，然后在液氮面上5cm处停留3分钟后直接投入液氮中保存；解冻时，将冷冻在液氮中存有精子的冻存管取出，37°C水浴中I分钟。
【文档编号】A01N1/02GK104304234SQ201410473950
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】蒙子宁, 李波, 刘晓春, 张勇, 林浩然 申请人:中山大学