一种高效保护玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体功能的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效保护玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体功能的方法，从而极大提 高冷冻卵母细胞中线粒体的功能及其发育能力。
【背景技术】
[0002] 随着世界人口的剧增和环境污染的日益严重，哺乳动物遗传资源储备急剧减少， 卵母细胞的冷冻保存成为保护物种资源多样性和拯救濒危动物的有效手段。同时，它也是 加快家畜品种改良、建立动物基因库和胚胎移植产业化的重要组成部分，并为克隆、转基因 等现代生物技术提供丰富的试验材料，使卵母细胞的供给和使用不受时间和空间的限制。
[0003] 然而，尽管哺乳动物和人卵母细胞冷冻保存研宄逐步开展并取得很大进展，但是 卵母细胞冷冻保存的研宄远远不及胚胎或精子冷冻保存的水平。研宄表明，相对于程序法 冷冻而言，玻璃化冷冻保存卵母细胞的效果要较好，但卵母细胞玻璃化冷冻保存后的发育 能力仍明显下降，例如：牛卵母细胞玻璃化冷冻后进行体外受精，囊胚率（17. 50% )较新鲜 卵母细胞（32.06% )下降了 50%左右。
[0004] 线粒体是细胞中含量丰富的细胞器，也是细胞的能量工厂，它通过氧化磷酸化为 细胞的各项生命活动提供ATP，同时它又是细胞凋亡的调控中枢和重要钙库。许多研宄已经 证实，线粒体的分布、膜电位等对卵母细胞的发育潜力有着非常重要的影响。目前，关于玻 璃化冷冻对线粒体冷冻造成的损伤、采用何种方法或措施能够减轻此损伤，都还缺乏深入 研宄。
【发明内容】
[0005] 针对上述不足，本发明提供了一种高效保护玻璃化冷冻牛卵母细胞中线粒体功能 的方法。
[0006] 本发明方法是在牛卵母细胞玻璃化冷冻过程中，在牛卵母细胞体外成熟液、玻璃 化冷冻液中添加MT，来高效保护牛卵母细胞中线粒体的功能。
[0007] 优选地，所述MT的添加浓度为KT7~KTkiIL更优选，所述MT的添加浓度为1(T9M。
[0008] 本发明还提供用于保护玻璃化冷冻牛卵母细胞中线粒体功能的玻璃化冷冻液，该 冷冻液含有MT，MT的含量优选为10_7~KTkiM,更优选为10_9M。在本发明实施例中，玻璃化 冷冻液为EDFSF40:EG、DMS0和FSF液按照体积比（v/v)2 : 2 : 6混匀，其中FSF液：含有 30%(?八）聚蔗糖？1(：〇1170、0.511蔗糖和20%?83的0?85溶液。
[0009] 此外，本发明还提供MT在保护玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体中的应用。
[0010] 本发明研宄表明，玻璃化冷冻会显著性提高牛卵母细胞中ROS水平，而异常升高 的ROS水平会导致线粒体膜功能异常（如膜电位下降等），MT处理能够显著性降低冷冻卵 母细胞中ROS水平、且与新鲜对照组无显著性差异。进一步研宄表明，玻璃化冷冻会使牛卵 母细胞中ATP含量显著降低（新鲜对照组0? 86pmol/卵母细胞，冷冻对照组0? 58pmol/卵 母细胞），而在牛卵母细胞体外成熟液和玻璃化冷冻液中添加MT时，能够有效保护卵母细 胞中线粒体功能，尤其是在添加KT9MT时表现出显著效果，其ATP产量与新鲜卵母细胞无显 著性差异（MT冷冻组0. 84pmol/卵母细胞，新鲜对照组0. 86pmol/卵母细胞）。说明在体 外成熟液和玻璃化冷冻液中添加KT9M MT，能够有效保护维持线粒体的功能。对冷冻卵母 细胞进行孤雌激活后发现，MT冷冻组卵母细胞孤雌激活后卵裂率（85. 63%，137/160)、囊 胚率（44. 53% ,61/137)均显著性高于冷冻对照组（54. 30%，101/186 ;26. 73%，37/101)， 且与新鲜对照组（88. 79%，95/107 ;46. 32%，44/95)无显著性差异，说明MT通过高效保护 卵母细胞中线粒体的功能，进而促进了冷冻卵母细胞的发育能力。
[0011] 本发明的优点，操作简单，对卵母细胞无毒无害，能有效保护冷冻卵母细胞的线粒 体功能及其发育能力，这对于提高冷冻卵母细胞的应用范围，具有重要的理论和实际意义。
[0012] 本发明的处理方法操作简单、费用不高、本发明将在牛的卵母细胞超低温冷冻研 宄领域发挥巨大作用。
【附图说明】
[0013] 图1是卵母细胞中ROS染色图标尺=20 ym;
[0014] 图2是MT处理、CsA处理对玻璃化冷冻牛卵母细胞中ROS水平影响的比较。
【具体实施方式】
[0015] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0016] 实施例1、MT、环孢霉素（CsA)对玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体功能保护功能的比 较
[0017] 1、卵母细胞的收集和体外成熟
[0018] 牛卵母细胞从当地屠宰场收集，保存在加有75 yg/mL青霉素和50 yg/mL链霉素 的35°C生理盐水中2h内送回实验室，从直径为2-8mm的卵泡中抽出卵丘-卵母细胞复合 体，挑选至少有3层致密卵丘细胞的复合体洗涤后用于体外成熟，约50个卵丘-卵母细胞 复合体一组放在500 y L成熟液做成的覆盖有矿物油的4孔板中38. 5 °C，5 % 0)2最大湿度 条件下培养。成熟液配方:M-199 (GibcoBRL公司，格兰德岛，纽约，美国）和IOyg/mL的卵 泡刺激素$311)，10 1^/1^黄体生成素（1^)，11^/1^雌二醇，10%的胎牛血清$85,6让(3〇 BRLDivision，格兰德岛，纽约，美国），IOyg/mL的肝素。
[0019] 2、OPS的制备
[0020] 按照Vajta等介绍的方法，做些改变制备OPS管，0.25mL的塑料管（I. M. V，莱格 勒，法国），高温变软后人为拉长，用显微控制仪测量使顶端外部直径为0. 23mm，管壁厚约 0. 02mnu
[0021] 3、预处理和玻璃化冷冻液
[0022] 预处理液：含有10%乙二醇（EG)+10%二甲基亚风（DMSO)的DPBS溶液。
[0023] 玻璃化冷冻液EDFSF40 :EG、DMS0和FSF液按照体积比（v/v)2 : 2 : 6混匀
[0024] FSF 液：含有 30% (w/v)聚蔗糖 Ficoll 70、0. 5M 蔗糖和 20% FBS 的 DPBS 溶液
[0025] 4、卵母细胞的冷冻与解冻
[0026] 体外成熟培养22-24h后，用0. 1%的透明质酸酶消化l-2min，消化掉复合物中的 卵丘细胞，挑选出有第一极体和胞质均匀的卵母细胞用于实验。卵母细胞在ED中孵化30s 转入EPFSF40中培养25s，然后装入OPS管中直接投入液氮中冻存。
[0027] 解冻时，把OPS管从液氮中取出，将装有卵母细胞的部分迅速溶于0.25M、38. 5°C 的蔗糖中，用口吸管将卵母细胞从OPS管吹出放于0. 25M的蔗糖中lmin，0. 15M的蔗糖中 5min，再