用成熟液洗两次。观察卵母细胞膜和透明带的完整性判断其存活情况。
[0028] 5、活性氧（ROS)水平测定
[0029] 卵母细胞解冻培养Ih后，从培养液中取出后在PBS中洗3遍，然后放入IOym DCFH-DA染色液中在37°C培养箱中染色20min。取出后在PBS中洗3遍，然后放入PBS滴中 在荧光显微镜下采集图像，用EZ-Clfreeviewer软件进行荧光强度分析。
[0030] 6、ATP含量分析
[0031] 用Van Blerkom等介绍的方法，做些改变分析ATP数目，利用ATP依赖性荧光 素-荧光素酶，进行生物荧光分析（ATP生物荧光分析，Kit HS II瑞士罗氏诊断股份有限 公司，曼海姆，德国），测定荧光产生量定量测定ATP数目。
[0032] 将20 y L细胞裂解试剂加到有20个卵母细胞的0. 5mL离心管中，吹打混匀使这些 细胞使其在里面均匀地溶解。溶液中ATP的浓度从0. 01升到10.0 pM，每个浓度分析一次， 绘制一条标准曲线。ATP待测液放到96孔板中平衡3-5min，随后分析标准液和样品发出的 光，用光度计（InfiniteM200, Tecan集团有限公司，奥地利）10s内就可测得。用连续稀释 液的相对光强度绘制出一条标准曲线，这样从标准曲线上就可看出样品ATP的浓度。
[0033] 7、孤雌激活
[0034] 卵母细胞先在5yM A23187(钙离子载体A23187)处理5min，然后放在2yM 6-DMAP中培养4h，激活后再向培养液加入10%的BSA，卵母细胞在38. 5。。，5% CO2条件下 继续培养48h，最后向培养液中再加10% FBS培养5天，在整个培养期内每2天换一次培养 液，记录卵裂率和囊胚率。
[0035] 8、实验设计
[0036] 根据实验设计，卵母细胞分为四组，（I)MT组：体外成熟液和玻璃化冷冻液中分 别各添加10'10'10'KT kiM MT ; (2)环孢霉素A (CsA)组：玻璃化冷冻液中添加40mg/ mLCsA ; (3)冷冻对照组：体外成熟液和玻璃化冷冻液中均不含MT或CsA ; (4)新鲜对照组： 体外成熟液不添加MT或CsA。卵母细胞体外成熟、玻璃化冷冻解冻后，挑选存活的卵母细胞 进行孤雌激活，比较四组之间ROS水平、ATP含量、发育能力之间的差异。
[0037] 9?数据统计
[0038] 采用SAS软件对实验数据进行分析，百分数比较时经反正旋转化后采用方差分 析，结果以平均数依标准差表示，P〈〇. 05为差异显著性标准。各处理组至少重复3次以上。
[0039] 1〇、实验结果
[0040] 实验I. MT处理、CsA处理对玻璃化冷冻牛卵母细胞中ROS水平影响的比较
[0041] ROS染色经典图片如图1所示。ROS结果表明（图2)，玻璃化冷冻显著性提高了 卵母细胞中ROS的水平（P〈0. 05)。MT处理组中，KT9M MT处理卵母细胞中ROS水平显著性 低于1〇1、1〇1、1〇^1 MT(P〈0. 05)，且与新鲜对照组无显著性差异（P>0. 05)。CsA处理组 ROS水平显著性低于冷冻对照组（P〈0. 05)但高于KT9M MT处理组（P〈0. 05)与新鲜对照组 (P〈0. 05) 〇
[0042] 实验2 :MT处理、CsA处理对玻璃化冷冻牛卵母细胞中ATP含量影响的比较
[0043] 如表1所示，玻璃化冷冻显著性降低了牛卵母细胞中ATP的含量（0.86pmol vs. 0. 58pmol，P〈0. 05)。MT处理组中，在牛体外成熟液和冷冻液中添加KT9M MT后卵母细 胞中 ATP 含量最高（0? 84pmol vs. 0? 69pmol、0. 71pmol、0. 73pmol ;P〈0. 05)，且与新鲜对 照组无显著性差异（〇.84pmol vs.0.86pmol，P>0.05)。CsA处理组卵母细胞中ATP含量 (0.72pmol)显著性高于冷冻对照组（0.58pmol，P〈0.05)，但低于新鲜对照组（P〈0.05)和 KT 9M MT 处理组（P〈0. 05)。
[0044] 表IMT处理对玻璃化冷冻牛卵母细胞中ATP含量的影响
[0047] a、b、c不同的上标表示纵列上数值差异显著（P〈0. 05)，以下表格也同样表示。
[0048] 实验3 :MT处理、CsA处理对玻璃化冷冻牛卵母细胞发育能力影响的比较
[0049] 如表2所示，玻璃化冷冻组卵母细胞的卵裂率（54.30% )、囊胚率（26.73% ) 显著性低于新鲜对照组（88. 79 %，46. 32 % ;P〈0. 05)。MT处理组中，KT9M MT的卵裂 率（85.63% )、囊胚率（44.53 % )显著均高于冷冻 KT7M MT(71. 95%，37.29 % )、1(T8M MT (72. 80%，35. 16% )、KTiqM MT (73. 94%，33. 33% ;P〈0. 05)且与新鲜对照组无显著性差 异（P>0. 05)。CsA处理组的卵裂率（74. 17% )、囊胚率（34. 82% )显著性高于冷冻对照组 (P〈0. 05)，但低于新鲜对照组（P〈0. 05)和KT9M MT处理组（P〈0. 05)。
[0050] 表2MT处理对玻璃化冷冻牛卵母细胞发育能力的影响
[0051]
[0052] 结论，由以上实验结果可以得出，与CsA处理比较，KT9M MT处理能够高效保护线 粒体功能，进而提高玻璃化冷冻牛卵母细胞的发育能力。
【主权项】
1. 褪黑素在保护玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体中的应用。2. -种保护玻璃化冷冻牛卵母细胞中线粒体功能的方法，该方法是在牛卵母细胞玻璃 化冷冻过程中，在牛卵母细胞体外成熟液、玻璃化冷冻液中添加MT。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MT的添加浓度为KT7~lO^M。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MT的添加浓度为10，。5. -种玻璃化冷冻液，其含有MT。6. 根据权利要求5所述的冷冻液，其特征在于，所述MT含量为KT7~10，。7. 根据权利要求6所述的冷冻液，其特征在于，所述MT含量为1(T9M。
【专利摘要】本发明公开了一种高效保护玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体功能的方法，该方法是在牛卵母细胞体外成熟液、玻璃化冷冻液中添加10-9M褪黑素(MT)，经该方法冷冻的牛卵母细胞中ATP含量及其体外发育能力与新鲜卵母细胞无显著性差异。应用本发明方法可以提高冷冻卵母细胞的发育能力和应用范围。本发明的方法操作简、成本低，将在牛卵母细胞冷冻保存方面发挥巨大作用。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN104886040
【申请号】CN201510119500
【发明人】赵学明, 朱化彬, 郝海生
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月18日