专利名称：一种基于大肠杆菌原核表达系统的制备死亡素的方法
技术领域：
本发明涉及到用大肠杆菌的原核表达系统制备死亡素，属于基因工程技术领域。
背景技术：
死亡素(thanatin)又称死亡肽，是在昆虫斑腹刺益蝽(Podisus maculiventris)中发现的，迄今为止在所有已知昆虫抗菌肽中，抗菌谱最广、抗菌活性最强的抗菌蛋白，由21个氨基酸残基组成，结构简单，具有抗肿瘤活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和某些真菌都有抑制作用，对哺乳动物细胞不表现出溶血性。然而，天然抗菌肽在昆虫体内含量甚微，分离提纯难度大，得率低。而目前的相关研究表明，采用分子生物学和基因工程方法在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿 主微生物自杀而不能获得表达产物，且易被蛋白酶降解，近期尚不能直接进行工业化生产。因此很有必要对已有的抗菌肽进行结构的修饰加工，或探索一种新型的技术路线进行大规模生产。
发明内容
由于大肠杆菌表达系统具有生长快、遗传背景清晰、表达水平高、产物易纯化、稳定性好、抗污染能力强、适用范围广以及成本低的特点，是理想的外源蛋白表达系统，为了克服现有技术的不足，本发明公开了一种基于大肠杆菌原核表达系统的制备死亡素的方法。本发明采用了如下技术方案
本发明提供一种重组基因，包括依次相连的融合伴侣基因序列、甲硫氨酸密码子、死亡素重复序列和终止密码子；死亡素重复序列由广15个死亡素基因串联而成，死亡素基因序列由死亡素的氨基酸序列逆推而来。作为优选，融合伴侣基因序列前还设有导肽序列，这样翻译出来的重组蛋白主要积累于宿主的周质空间，不会对宿主造成伤害。作为优选，所述融合伴侣基因序列为多角体蛋白基因从起始密码子开始的90个碱基序列；融合伴侣的作用是促进死亡素的表达，有利于形成包涵体蛋白。本发明还提供包含上述重组基因的原核表达质粒。本发明还提供包含上述原核表达质粒的大肠杆菌。本发明还提供了制备死亡素的方法，包括如下步骤
(1)诱导如上所述的大肠杆菌内表达重组蛋白；
(2)分离纯化重组蛋白；
(3)用溴化氰处理，将重组蛋白切割成多个独立完整的死亡素；
(4)分离纯化死亡素。本发明的原理如下
溴化氰具有专一性裂解甲硫氨酸残基的羧基侧肽键的性质；由于死亡素C末端的最后一个氨基酸残基为甲硫氨酸，内部无甲硫氨酸，另外由于在死亡素重复序列的5端设有甲硫氨酸密码子，故用溴化氰处理重组蛋白能得到多个独立完整的死亡素；而融合伴侣内含有甲硫氨酸，因此被切割成多个小片段，方便与死亡素进行分离。本发明的创新之处在于，通过溴化氰裂解，可一次性获得多个独立完整的死亡素；为了提高蛋白的表达量，将死亡素和融合伴侣融合表达，这为死亡素快速、有效、大量的制备提供了新思路、新途径，同时为相关领域的科学研究和药物开发等方面奠定了良好的基础，同时还避免了对宿主的毒性作用。
图I为重组蛋白SDS-PAGE检测图，其中，Lane M :低分子量蛋白质标准；Lane I 未诱导空载体；Lane 2 :诱导后空载体；Lane 3 :未诱导重组菌；Lane4 :诱导后重组菌，黑色箭头所示为重组蛋白。图2为重组基因全序列图黑框表示的序列分别为甲硫氨酸密码子和终止密码 子，二者之间为5重序基因序列；单下划线部分为导肽序列，双下划线部分为多角体蛋白基因从起始密码子开始的90个碱基序列。
具体实施例方式下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。实验例I构建重组质粒
化学合成重组基因，包括依次相连的导肽序列、多角体蛋白基因从起始密码子开始的90个碱基序列、甲硫氨酸密码子、死亡素重复序列和终止密码子；死亡素重复序列由5个死亡素基因串联而成，死亡素基因序列由死亡素的氨基酸序列逆推而来。重组基因序列见SEQID NO : I。将该重组基因装载于表达载体，得到重组质粒。用Sanger法测序，以验证重组基因序列的正确性。需要明确说明的是，构建原核表达质粒的方式有多种，是本领域普通技术人员容易做到的，化学合成重组基因后载入表达载体只是其中的一种方式而矣；另外，这里采用5个死亡素基因串联，是为了操作、检测的方便，以现有技术来看，广15的死亡素基因串联都是允许的。
实验例2诱导重组蛋白的表达及SDS-PAGE检测
用IPTG诱导含重组质粒的大肠杆菌表达重组蛋白，分离纯化重组蛋白，并通过SDS-PAGE检测重组蛋白的大小。如图I所示，诱导后，重组蛋白表达非常明显。分离纯化的重组蛋白不包括导肽，导肽完成引导功能后，在大肠杆菌内被切除。包含导肽的完整的重组蛋白氨基酸序列见SEQ ID NO 2。
实验例3用溴化氰处理重组蛋白
用溴化氰处理实验例2得到的重组蛋白，将重组蛋白切割成多个独立完整的死亡素；分离纯化死亡素。
实验例4检测死亡素活性
大肠杆菌抑菌实验表明实验例3制备·的死亡素具有强抗菌活性。
权利要求
1.一种重组基因，其特征在于，包括依次相连的融合伴侣基因序列、甲硫氨酸密码子、死亡素重复序列和终止密码子；死亡素重复序列由广15个死亡素基因串联而成，死亡素基因序列由死亡素的氨基酸序列逆推而来。
2.如权利要求I所述的重组基因，其特征在于，融合伴侣基因序列前还设有导肽序列。
3.如权利要求I所述的重组基因，其特征在于，所述融合伴侣基因序列为多角体蛋白基因从起始密码子开始的90个碱基序列。
4.含权利要求f3任一项所述重组基因的原核表达质粒。
5.含权利要求4所述重组基因的原核表达质粒的大肠杆菌。
6.一种制备死亡素的方法，包括如下步骤 (1)诱导如权利要求5所述的大肠杆菌内表达重组蛋白； (2)分离纯化重组蛋白； (3)用溴化氰处理，将重组蛋白切割成多个独立完整的死亡素； (4)分离纯化死亡素。
全文摘要
本发明涉及到用大肠杆菌的原核表达系统制备死亡素，属于基因工程技术领域。本发明一种重组基因，包括依次相连的融合伴侣基因序列、甲硫氨酸密码子、死亡素重复序列和终止密码子。本发明还提供含上述重组基因的原核表达质粒以及含该原核表达质粒的大肠杆菌。本发明还提供一种基于大肠杆菌原核表达系统的制备死亡素的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)诱导上述大肠杆菌表达重组蛋白；(2)分离纯化重组蛋白；(3)用溴化氰处理，将重组蛋白切割成多个独立完整的死亡素；(4)分离纯化死亡素。本发明的创新之处在于，通过溴化氰裂解，可一次性获得多个独立完整的死亡素；而且死亡素表达量高。
文档编号C12N1/21GK102943077SQ201210507640
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者陈利淼, 王涛, 刘云龙, 任飞, 吕正兵 申请人:杭州蚕宝生物技术有限公司