专利名称：一种座壳孢次生代谢产物的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种座壳孢次生代谢产物的提取方法。技术背景
座壳孢(AscAer1SOflia)是虫生真菌的重要成员，隶属于子囊菌门、粪菌纲、肉座菌目、麦角菌科。座壳孢孢子具有杀粉虱活性，并有商品化的制剂。经研究其代谢产物也具有杀粉虱、蚜虫等的活性，而且由于代谢产物不受温度、雨水等环境因素的影响，因此具有潜在的应用价值。不仅在农药方面有一定的应用价值，在医药方面也具有潜在的开发价值，已研究座壳孢代谢产物在抗结核杆菌、疟原虫、肿瘤细胞等方面也有一定的活性，所以若要大规模提取应用，首先要考虑提取方法的优化。
发明内容
本发明的目的提供一种优化座壳孢次级代谢物的提取方法，用该方法提取的次级代谢物质量多，种类丰富，为大规模生产次级代谢物提供了参考条件。本发明提供了一种座壳孢次生代谢产物的提取方法，所述方法的具体步骤为
1)初级、次级培养座壳孢菌(邱君志等，昆虫病原真菌粉虱座壳孢对烟粉虱侵染行为的初步研究.菌物学报，2004,23(1) :115 121)活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在13(Tl60r/min、24 28°C条件下连续培养7 10天即初级培养，按8% 10%接种量再次转接到PDB培养基中，在24°C 28°C条件下静止培养35 40天即得次级代谢产物；
2)冷浸提取菌液与菌丝体过滤分离，菌丝体在3°C 12°C的有机溶剂中浸泡48 100小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在35°C 40V得浸膏，回收有机溶剂；
3)摇瓶萃取加水溶解浸膏，水与浸膏重量比为50:1 100:1,将水溶物倒入分液漏斗中，加入I 2倍的乙酸乙酯进行摇瓶萃取,摇瓶转速为150r/min 280r/min,摇20 60min后静止IOOmin 200min,取乙酸乙酯部分,旋蒸浓缩得到粗提物，回收乙酸乙酯。所述PDB培养基的制备为200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L。更优选的，所述步骤2)菌丝体在4°C 10°C的有机溶剂浸泡48 72小时。所述步骤2)中的有机溶剂为丙酮、乙醇、甲醇中的任一种。更优选的，步骤3)所述的摇瓶萃取条件为200 250r/min摇20 40min后静止100 150mino步骤3)所获得的粗提取物通过GC-MS (气相色谱质谱联用)检测。本发明的显著优点
本发明提供了一种优化座壳孢次级代谢物的提取方法，用该方法提取的次级代谢物质量多，种类丰富，且应用GC-MS进行检测物质更精确，为大规模生产座壳孢的次级代谢物提供了参考条件。
图1为实施例1座壳孢菌挥发性成分GC-MS总离子流图谱；图2为实施例2座壳孢菌挥发性成分GC-MS总离子流图谱；
图3为实施例3座壳孢菌挥发性成分GC-MS总离子流图谱；
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但是本发明不限于此。以下各实施例中PDB培养基的制备为200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L。实施例1 :1)座壳孢菌活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在130r/min、24°C条件下连续培养7天即初级培养，按8%接种量再次转接到PDB培养基中，在24°C条件下静止培养35天即次级代谢产物。
2)菌液与菌丝体过滤分离，将菌丝体在3°C、甲醇中浸泡48小时，过滤得浸泡液，温度在35°C下旋蒸浓缩得浸膏，回收甲醇。3)加水溶解浸膏(水浸膏重量比=50:1 )，将水溶物倒入分液漏斗中，加入I倍的乙酸乙酯进行摇瓶萃取，摇瓶转速为150r/min摇60min,静止IOOmin,取乙酸乙酯部分，旋蒸浓缩得粗提物，回收乙酸乙酯。4)用色谱甲醇将粗提物配成浓度为lmg/ml的溶液，用于GC-MS检测，结果见图1和表I。表I座壳孢菌挥发性成分的GC-MS分析
权利要求
1.一种座壳孢次生代谢产物的提取方法，其特征在于所述方法的具体步骤为 1)初级、次级培养座壳孢菌活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在130 160r/min、24 28°C条件下连续培养7 10天即初级培养，按8% 10%接种量再次转接到PDB培养基中，在24°C 28°C条件下静止培养35 40天即得次级代谢产物； 2)冷浸提取菌液与菌丝体过滤分离，菌丝体在3°C 12°C的有机溶剂中浸泡48 100小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在35°C 40V得浸膏，回收有机溶剂； 3)摇瓶萃取加水溶解浸膏，水与浸膏重量比为50:1 100:1,将水溶物倒入分液漏斗中，加入I 2倍的乙酸乙酯进行摇瓶萃取,摇瓶转速为150r/min 280r/min,摇20 60min后静止IOOmin 200min,取乙酸乙酯部分,旋蒸浓缩得到粗提物，回收乙酸乙酯。
2.根据权利要求1所述的一种座壳孢次生代谢产物的提取方法，其特征在于所述TOB培养基的制备为200g马铃薯,20g葡萄糖,沸水煮30min,经4层纱布过滤后加单蒸水定容至IL0
3.根据权利要求1所述的一种座壳孢次生代谢产物的提取方法，其特征在于所述步骤2)中的菌丝体在4°C 10°C的有机溶剂浸泡48 72小时。
4.根据权利要求1所述的一种座壳孢次生代谢产物的提取方法，其特征在于所述步骤2)中的有机溶剂为丙酮、乙醇、甲醇中的任一种。
5.根据权利要求1所述的一种座壳孢次生代谢产物的提取方法，其特征在于步骤3)所述的摇瓶萃取条件为200 250r/min摇20 40min后静止100 150min。
6.根据权利要求1所述的一种座壳孢次生代谢产物的提取方法，其特征在于步骤3)所获得的粗提取物通过GC-MS检测。
全文摘要
本发明涉及一种座壳孢次生代谢产物的提取方法，所述方法包括菌株的初级、次级培养，冷浸提取，摇瓶萃取得粗提取物，利用GC-MS检测粗提物，应用该提取方法得到的粗提取物质量多、种类丰富，并且该方法设备简单、使用成本低、易操作，为大规模生产提供了参考条件。
文档编号C12P1/02GK103014066SQ20121050781
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者邱君志, 毛丽慧, 郭庆丰, 李小霞, 何肖云, 张以盼, 孟丽雪, 曹丽萍, 邱云锋 申请人:福建农林大学