利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法。
【背景技术】
[0002]多杀菌素，是刺糖多孢菌有氧发酵产生的次级代谢产物，属于大环内酯类化合物，其商业化产品中有效活性组分为多杀菌素A(85-90% )和多杀菌素D(10-15% )。多杀菌素没有抑菌活性，却有很好的杀虫活性，对鳞翅目和缨翅目害虫有较广的杀虫谱，对双翅目、鞘翅目和膜翅目中某些大量吞食叶片的害虫种类有很好的防治作用，在防治鳞翅目害虫上，多杀菌素是现有杀虫剂中选择性最高的化合物之一，其活性与氯氰菊酯相当。多杀菌素具有高杀虫活性的同时，对非靶标生物则表现出低毒，它对哺乳动物、鸟类和有益昆虫毒性较低，对水生动物只有轻微的毒性，而且对哺乳动物无致癌、致畸、致突变或神经毒性的作用。多杀菌素在环境中通过多种组合途径降解，主要为光降解和微生物降解，降解产物为对环境无害的碳、氢、氧、氮等自然组分，且降解周期短，在土壤中多杀菌素光降解的半衰期为9-10天，在水中多杀菌素光降解的半衰期则小于I天，在叶面上多杀菌素光降解的半衰期是1.6-16天。与一般杀虫剂相比，多杀菌素具有见效快、无副作用、选择性高、对天敌安全、半衰期短、易降解、不易产生药物抗性等优点，是理想的高效低毒绿色农药，是治理抗性害虫的首选替代农药新品种。
[0003]目前在我国，多杀菌素还未实现产业化，其中菌株发酵单位低，发酵周期长，成本高，发酵工艺控制复杂，分离纯化工艺不成熟都是制约其发展的因素。
[0004]在微生物好气培养中，由于外力作用(通气和搅拌)、微生物的代谢及培养基的成分等原因往往会使发酵液产生许多泡沫，但是过多的泡沫会给发酵带来负面影响，如引起逃液不仅使工艺控制更加复杂还增加了染菌机会，而因泡沫液位变化在罐壁上形成的菌环会让发酵液中的菌体量减少，从而影响发酵效率。在多杀菌素发酵的过程中同样需要解决消沫问题。目前消除和控制泡沫主要有机械消沫和消沫剂两种方法。机械消沫普遍来说效率不高，而且不能消除引起泡沫的根本原因。而市售的化学类消沫剂(聚醚类消泡剂、硅酮类消沫剂、高级醇类消沫剂等)对多杀菌素的发酵影响均较大，此外大量消沫剂的加入也给后续多杀菌素提取工作带来困难。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法。
[0006]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种刺糖多胞菌发酵培养基，所述发酵培养基中含有如下组分:高温黄豆饼粉5-30g/L、玉米淀粉20-40g/L、葡萄糖30_50g/L、玉米衆15-20g/L和碳酸|丐4-6g/L,以水配制。
[0007]优选地，所述发酵培养基中还包括棉籽饼粉10_20g/L和/或酵母浸粉l_5g/L和/或豆油4-6g/L。
[0008]本发明还提供一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，以刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) Z68为发酵菌株，采用权利要求1或2所述的发酵培养基,发酵条件为:26-30°C，转速150-220rpm，通气比1:0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa，溶氧控制在40%以上，发酵周期为168-216hr ;发酵开始后第120hr内，第一次补加豆油和葡萄糖，豆油至终浓度10_30g/L，葡萄糖至终浓度10-40g/L ;发酵开始后第120_192hr内，第二次补加葡萄糖至终浓度10-40g/L。
[0009]优选地，发酵条件为:28°C，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40%以上，发酵周期为192hr。
[0010]本发明中涉及的刺糖多胞菌为刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) Z68,该菌已在ZL201110224366.3中公开。
[0011]本发明从刺糖多胞菌发酵培养基的理化性质入手，提供一种多杀菌素产量稳定、起沫少的发酵培养基及补料方法。将发酵培养基中的大豆粉/豆饼粉用高温黄豆饼粉替代，实验表明在发酵过程中高温黄豆饼粉较大豆粉和低温黄豆饼粉不易起沫，而高温黄豆饼粉较大豆粉和低温黄豆饼粉缺少的部分油脂可以在发酵中后期外源加入，此时加入即可以起到消沫的作用又解决了后期碳源不足的问题。
【附图说明】
[0012]图1为本发明实施例2中多杀菌素标准品的高效液相色谱图。
[0013]图2为本发明实施例2中供试液高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0015]实施例1刺糖多胞菌发酵培养基
[0016]本实施例中，刺糖多胞菌发酵培养基的配方为:高温黄豆饼粉10g/L、玉米淀粉30g/L、葡萄糖30g/L、玉米浆20g/L、棉籽饼粉10g/L、酵母浸粉5g/L、碳酸钙5g/L和豆油5g/L,以水配制。灭菌前调培养基pH至7.0，121°C，灭菌30min。
[0017]实施例2利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法
[0018]以刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) Z68为发酵菌株,采用实施例1的发酵培养基，按5-15% (v/v)接种比例向上述发酵培养基中接种刺糖多胞菌种子液，进行发酵培养。发酵条件为:28°C，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40%以上，发酵周期为192hr。发酵开始后第96hr，第一次补加豆油至终浓度30g/L，补加葡萄糖至终浓度30g/L，发酵开始后第144hr，第二次补加葡萄糖至终浓度30g/L。
[0019]其中，刺糖多胞菌种子液的制备方法为:挖取Icm2长满刺糖多孢菌的斜面菌苔，将其转接入盛有30mL灭菌的种子培养基的种子瓶中，在28°C，环境相对湿度为50-60%，转速200rpm，旋转半径50_的条件下，振荡培养，48-72小时，得到刺糖多胞菌种子液。
[0020]种子培养基配方:糊精20g/L、葡萄糖10g/L、玉米浆6g/L、豆柏粉3g/L和硫酸镁2g/L,以水配制。种子培养基的pH值为7.0,121°C，灭菌30min。
[0021]发酵液中多杀菌素含量分析:
[0022]I)取发酵液Iml，加入9ml甲醇溶液，摇匀；
[0023]2)超声波震荡20min，静止lOmin，使固液分层；
[0024]3)取上层有机相，以0.45 μ m有机滤膜进行过滤；
[0025]4)过滤后有机相作为供试液通过高效液相色谱仪进行效价检测；
[0026]5)高效液相色谱条件:150X4.6mm(id)，5ym，不锈钢C18反相色谱柱；柱温35°C，流速1.0mL/min，以甲醇:乙腈:水(体积比为9: 10: I)为流动相进行分离，进样量20 μ 1，利用紫外检测器在246nm波长下进行检测。
[0027]在此色谱条件下多杀菌素标准品高效液相色谱见图1。供试液高效液相色谱见图
2。根据保留时间计算各组分峰面积值，通过峰面积计算各组分产量。
[0028]使用本实施例中的培养基配方和补料方法，得到多杀菌素产量为15.6g/L。
[0029]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.刺糖多胞菌发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中含有如下组分:高温黄豆饼粉5-30g/L、玉米淀粉20-40g/L、葡萄糖30_50g/L、玉米浆15_20g/L和碳酸钙4_6g/L，以水配制。2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中还包括棉籽饼粉10-20g/L和/或酵母浸粉l_5g/L和/或豆油4-6g/L。3.利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于，以刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) Z68为发酵菌株,采用权利要求2所述的发酵培养基,发酵条件为:26-30°C，转速150-220rpm，通气比1:0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa，溶氧控制在40%以上，发酵周期为168-216hr ;发酵开始后第120hr内，第一次补加豆油和葡萄糖，豆油至终浓度10_30g/L，葡萄糖至终浓度10-40g/L ;发酵开始后第120_192hr内，第二次补加葡萄糖至终浓度10-40g/L。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵条件为:28°C，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40%以上，发酵周期为192hr。
【专利摘要】本发明提供一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，其是以刺糖多胞菌(Saccharopolyspora？spinosa)Z68为发酵菌株，采用改良的发酵培养基，在26-30℃，转速150-220rpm，通气比1:0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa，溶氧控制在40％以上的条件下进行发酵培养，从发酵液中提取多杀菌素。本发明从刺糖多胞菌发酵培养基的理化性质入手，提供一种多杀菌素产量稳定、起沫少的发酵培养基及补料方法。将发酵培养基中的大豆粉/豆饼粉用高温黄豆饼粉替代，实验表明，在发酵过程中高温黄豆饼粉较大豆粉和低温黄豆饼粉不易起沫，而高温黄豆饼粉较大豆粉和低温黄豆饼粉缺少的部分油脂可以在发酵中后期外源加入，此时加入即可以起到消沫的作用又解决了后期碳源不足的问题。
【IPC分类】C12P19/62, C12R1/645
【公开号】CN105506038
【申请号】CN201410503746
【发明人】王书睿, 周贤龙
【申请人】牡丹江佰佳信生物科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月26日