一种莪术烯醇的微生物转化产物的制备方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药技术领域，确切地说它是一种莪术烯醇的微生物转化产物及其用 途和制备方法。
【背景技术】
[0002] 一氧化氮（N0)是在生物体内由L-精氨酸（L-arginine，L-Arg)在诱导型一 氧化氮合酶（iNOS)的作用下生成的一种无机小分子自由基，是一种生物体内重要的 信使分子和神经递质，参与调节机体的许多生理或病理过程，如血管舒张，非特异性 宿主防御反应，局部缺血再灌损伤，慢性或急性炎症反应等（Bioorganic&Medicinal Chemistry,2001，9, 1887-1893)。研究证实在一些类型的细胞如巨噬细胞，上皮细胞，和平 滑肌细胞中通过应答一些前炎症因子如白介素-lb (IL-lb)，肿瘤坏死因子（TNF-a)和脂 多糖（LPS)等的刺激可以激活诱导型一氧化氮合酶（iNOS)表达而导致过量产生N0。机体 中N0的过量产生会非选择性地造成细胞和组织损伤，引发各种疾病（生命科学，1998,10， 188-190 ;国外医学免疫学分册，1995,4, 204-206)。高水平的N0与感染、炎症和自身免疫过 程有关，可介导炎症、休克、哮喘等疾病的发生(江西医学院学报，2005,45,176-178 ;解剖科 学进展，2005,11，268-271)。因此能够有效的抑制机体由于病理过程引起的N0过量产生代 表着一种有效的治疗手段。
[0003] 莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val.、广西莪术Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang或温郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling 的干燥根茎（中华人民共和国药典（一部），2010, 257-258)。2010年版《中国药典》记载： 莪术味辛、苦，性温，是常用的传统中药之一。具有行气破血、消积止痛之功效，用于瘀血经 闭、食积腹胀等，是临床上较为常用的活血化瘀药物。中药近年来，其抗肿瘤、抗病毒、抗菌 和抗血栓等作用在临床上已得到证实，是一个具有广阔开发前景的中药。
[0004] 莪术烯醇（curcumenol)是莪术的主要化学成分之一，尤其是在蓬莪术 Curcuma phaeocaulis Val.中的含量较高。前期研究表明，莪术烯醇具有显著的抗炎 作用，能够显著抑制由脂多糖刺激引起的巨噬细胞中N0的产生（Journal of Natural Products，2013, 76, 1150-1156)。莪术烯醇属于愈创木烷型倍半萜，是五元环与七元环相互 骈合的结构，日本学者Hiroshi Hikino在1968年首先从curcuma zedoaria挥发油中分离 并鉴定了莪术烯醇的结构（Chemical&Pharmaceutical Bulletin,1968, 16:39-42)。但由于 其水溶性很差，易溶于乙酸乙酯、氯仿等小极性有机溶剂中，影响了其制剂的形成和药物开 发。鉴于其结构中化学可变化位点的局限性，采用有机化学方法对它进行结构修饰存在一 定的难度，且未见文献报道。
[0005] 微生物转化是指某一微生物将一种物质转化成为另一种物质的过程，这一过程是 由此种微生物产生的一种或者几种特殊的胞内或胞外酶作为生物催化剂来进行的一种或 者几种化学反应，即为一种利用微生物酶或者微生物本身来进行的合成技术(精细化工原 料及中间体，2005, 10, 5-7)。微生物转化操作更简单，有利于大规模工业生产，具有低毒、低 污染、能耗少、效率高、选择性良好等优点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种微生物转化的方法制备莪术烯醇衍生物的方法，用 以发现较底物活性更强，水溶解性更好，更适合药物制剂的有效化合物。本实验使用 刺囊毛霉MucorspinosusAS3. 2450 (购自中国科学院微生物研究所）对莪术烯醇进 行了微生物转化反应，获得了 一种具有更强抗炎活性的新化合物la-羟基莪术烯醇 (1a-hydroxycurcumenol)。该化合物为莪术烯醇在刺囊毛霉发酵过程中的主要转化产物， 收率较商，最商可达52%。
[0007] 具体步骤如下：
[0008]a)土豆液体培养基的配制：取新鲜土豆，去皮，切成2cm3小块，加入5倍量水煮沸， 保持沸腾状态30分钟，用纱布过滤残渣，滤液加水定容(每200克土豆配制1升培养液)，定 容后加入2%葡萄糖。将配好的培养液进行分装，250mL的锥形瓶可装入60mL培养液，500mL 锥形瓶可装入200mL培养液。用纱布及牛皮纸将瓶口封好，放入高压灭菌锅中灭菌。灭菌 条件为115°C灭菌30min。
[0009]b)微生物的培养：将刺囊毛霉MucorspinosusAS3. 2450从土豆葡萄糖琼脂固体 培养基（PDA)上接种(接菌面积约为0. 05cm2)至上述配制好的土豆液体培养基中，置于摇床 中于160-220印111，26-281：条件下培养1-3天，优选，160卬111，261：，2-3天。
[0010]C)加入底物：将底物莪术烯醇用适量用适量丙酮溶解，配成10mg/mL的丙酮溶液。 加入到已培养1-3天的步骤b)的微生物发酵液中，在相同条件下继续培养3-10天，优选 6-8 天。
[0011] d)发酵液的处理：步骤c)的发酵液抽滤后收集滤液，减压条件下低温浓缩至小体 积，用等体积乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并浓缩至干，获得粗浸膏。
[0012]e)转化产物的分离纯化：将步骤d)得到的蒸干后的粗浸膏利用硅胶柱色谱进行 分离，用石油醚：丙酮系统洗脱（100:1-2:1)。对石油醚：丙酮=20:1洗脱得到的流份继续 采用硅胶柱色谱分离，洗脱溶剂系统为石油醚：乙酸乙酯（20:1-5:1)，石油醚：乙酸乙酯 =15:1洗脱条件下得到转化产物1a-羟基莪术烯醇，其纯度经薄层色谱及高效液相色谱检 测达到98%以上，结构如下所示：
【主权项】
1. 一种莪术烯醇的微生物转化产物，其特征在于，转化产物的结构为（1)所示的 Ic-羟基莪术烯醇
2. -种如权利要求1所述的莪术烯醇的微生物转化产物的制备方法，其特征在于：利 用微生物刺囊毛霉量/corAS3. 2450对底物莪术烯醇进行生物转化，并利用乙酸 乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取、利用硅胶柱色谱法对转化产物进行分离纯化。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： a) 土豆液体培养基的配制； b) 微生物的培养：将刺囊毛霉量/corAS3. 2450从土豆葡萄糖琼脂固体培 养基上接种至上述配制好的土豆液体培养基中，置于摇床中培养1-3天； c) 加入底物：将底物莪术烯醇用适量丙酮溶解，配成lOmg/mL的丙酮溶液，加入到b)的 微生物发酵液中，在相同条件下继续培养3-10天； d) 发酵液的处理：步骤c)的发酵液抽滤后收集滤液，减压条件下低温浓缩至小体积， 用等体积乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并浓缩至干，获得粗浸膏； e) 转化产物的分离纯化：将步骤d)得到的蒸干后的粗浸膏利用硅胶柱色谱进行分离， 用石油醚：丙酮=100:1-2:1系统洗脱，对石油醚：丙酮=20:1洗脱得到的流份继续采用硅 胶柱色谱分离，洗脱溶剂系统为石油醚：乙酸乙酯=20:1-5:1，石油醚：乙酸乙酯=15:1洗脱 条件下得到转化产物1 〃 _羟基莪术烯醇。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤b)接菌面积为0.05cm2。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤b)和c)的培养条件为 160-220rpm,26-28°C0
6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤b)培养2-3天。
7. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤c)培养6-8天。
8. -种药物组合物，包含权利要求1所述的莪术烯醇的微生物转化产物。
9. 权利要求1所述的莪术烯醇的微生物转化产物1 〃 -羟基莪术烯醇或权利要求8所 述的药物组合物在制备治疗炎症药物中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的炎症药物是预防或治疗与一氧化 氮信号传导有关疾病的药物。
【专利摘要】本发明公开了一种莪术烯醇的微生物转化产物及其用途和制备方法。转化产物的结构为1α-羟基莪术烯醇。所述转化产物1α-羟基莪术烯醇可用于预防和/或治疗人类和动物的抗炎药物。利用微生物刺囊毛霉MucorspinosusAS3.2450对底物莪术烯醇进行生物转化，并利用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取、利用硅胶柱色谱法对转化产物进行分离纯化。所制得的转化产物，其纯度可达98%以上。
【IPC分类】C12P17-18, C07D493-08, C12R1-785, A61K31-352, A61P29-00
【公开号】CN104710434
【申请号】CN201310690914
【发明人】陈丽霞, 邱峰, 赵烽, 赵倩
【申请人】沈阳药科大学, 沈阳药科大学(本溪)医药科技有限公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月13日