一株拟诺卡氏放线菌及其活性代谢产物的分离方法与应用
【专利摘要】一株拟诺卡氏放线菌及其活性代谢产物的分离方法与应用，本发明涉及到的菌种是拟诺卡氏放线菌NX032，Nocardiopsissp.NX032，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为 CCTCC NO：M 2015361。本发明还包括拟诺卡氏放线菌的活性代谢产物的分离与应用。本发明拟诺卡氏放线菌活性代谢产物具有广谱抗肿瘤活性。CCTCC NO：M 201536120150608
【专利说明】
一株拟诺卡氏放线菌及其活性代谢产物的分离方法与应用
技术领域
[0001]本发明涉及一株拟诺卡氏放线菌及其活性代谢产物的分离方法与应用，尤其是涉及一株高效抗肿瘤野生型菌株(Nocard1psis sp.NX032)及其活性代谢产物的分离方法与应用。
【背景技术】
[0002]拟诺卡氏菌属(Nocard1psis)是放线菌纲放线菌目链孢囊菌亚目拟诺卡氏菌科下的一个属，1976年由Meyer有效描述，是一类高G+C含量革兰氏阳性好氧菌。该属菌株的主要特征:革兰氏阳性，好气，中温，化能有机营养型;基内菌丝发育良好，长、多分枝，会断裂成杆、球体。气生菌丝发育良好，长、中等分枝，直或Z字型，全部断裂成长度不同的杆状孢子。孢子表面光滑，细胞壁含meso-DAP，无特征性糖，无枝菌酸，优势的甲基萘醌是MK-1O(!12，!14，!16)或厭-9(!14，册)。脂肪酸33型，磷脂？111型，0嫩的(6+011101%为70%-76%。通过我们追踪发现，到2014年I月该属的有效发表种己经达到53个。拟诺卡氏菌在各种环境中均有分布，在中度和高盐环境中表现出了优势菌群的特征。
[0003]从青霉素诞生到21世纪初，微生物产生的抗生素共有约22500种，其中来自于真菌的约为8600种，占38%，来自于细菌的约为13900种，占62%。细菌来源的抗生素中产自放线菌的超过10000种，占73%，产自其他细菌的活性化合物约为3800种，占27%。所以，放线菌一直以来都是人类发现有效抗生素的主要来源。但由于近几十年从链霉菌中发现新抗菌药物的几率越来越小，从稀有放线菌中寻找新抗菌药物作为菌排重的研究策略逐渐成为研究重点。稀有放线菌狭义上指非链霉菌属的放线菌，使用常规的分离方法时，它们较链霉菌的出菌率低很多。稀有放线菌产生的一些抗菌化合物，己经成为药物并在临床上广泛使用，如庆大霉素、红霉素、万古霉素、利福平等。
[0004]近年来该菌属次级代谢产物发现进展迅速，发现了许多新的抗生素。如厦门大学沈月毛课题组分离到拟诺卡氏菌Nocard1psis A00203(与DSM44442的相似率为98% )，并从其发酵液中分离得到3个新3，6_二取代的2-吡喃酮(α-吡喃酮)衍生物，分别命名为Norcardiatones A-Cc3MTT细胞毒活性检测表明，Norcardiatones A对Hela细胞具有较弱的细胞毒活性，Norcardiatones B和C无细胞毒活性;澳大利亚Robert J.Capon课题组从澳大利亚东北部昆士兰州采集的海泥中分离到拟诺卡氏菌Nocard1psis sp.(CMB-M0232),2010年从该菌株的发酵液中分离得到1100&1(1;[(^8；[118々和1100&1(1;[(^8；[11813，2013年该课题组从该菌株的代谢产物中分离到nocard1psins C和nocard1psinsD。这4个化合物均是聚酮类大环内酯化合物。Nocard1psins A和nocard1psins B没有抗真菌、抗细菌和细胞毒活性。它们与免疫抑制剂FK506和雷帕霉素的构效关系一致。能够在低摩尔浓度时与免疫亲和素FKBP12结合;William Fenical研究组从拉丁美洲北部巴哈马岛上的盐碱池塘分离到菌株Nocafd1psis lucentensis (CNR-712)，并从其发酵液中分离到5个肽类化合物:Lucentamycins A-E，化合物Lucentamycins A和Lucentamycins B对人类结肠癌HTC-116具有明显的的细胞毒性，其IC5q值分别为0.20μΜ和I ΙμΜ，化合物Lucentamycins C和Lucentamycins D在浓度达为150μΜ时，对该结肠癌细胞也无明显的细胞毒性。但这些物质的抗肿瘤活性谱较窄，在筛选的菌株中发现新的抗肿瘤活性物具有重要的意义。
[0005]目前，拟诺卡氏菌属次生代谢产物生物活性研究主要集中在三个方面:抗肿瘤、抗癌活性化合物;抗炎症、抗感染化合物;非细胞毒性、非抑菌活性化合物。虽然人们在拟诺卡氏菌属的新种发现、次生代谢产物研究中取得了进展，但是获得的化合物数量仍不可观，同时对新化合物作用机制、生物合成机制的研究仍然缺乏。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株具有广谱抗肿瘤活性且活性较好的拟诺卡氏放线菌及其活性代谢产物的分离方法与应用。
[0007]本发明解决其技术问题采用的技术方案是:
[0008]本发明之拟诺卡氏放线菌，是拟诺卡氏放线菌NX032(Nocard1psis sp.NX032)，该菌种于2015年6月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址:中国武汉武汉大学)，菌种保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2015361。
[0009]本发明之拟诺卡氏放线菌NX032(NOCard1pSis sp.NX032)的分离鉴定:采用高氏一号培养基筛选法，从湖南稻田地采集的土样中直接分离得到一株放线菌，经菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化特征、16S rRNA基因同源性分析，鉴定该菌株为Nocard1psis属，命名为拟诺卡氏放线菌NX032(Nocard1psis sp.NX032)。
[0010]抗肿瘤生物活性:
[0011]将拟诺卡氏放线菌NX032在摇瓶(优选300ml摇瓶)中发酵培养10-12天后，离心，收集上清，进行肿瘤细胞毒性实验。
[0012]抗肿瘤蛋白的分离纯化:将拟诺卡氏放线菌NX032置于发酵培养基中，在28-30°C，160一 170rpm/min条件下，振荡培养 10-12天后，以8000 — 12000rpm/min离心 15_20min(最好重复离心3次以上)，收集发酵上清液，采用不同浓度梯度的硫酸铵沉淀蛋白；接着在蛋白质纯化仪上进一步分离纯化，收集具有生物活性的组分，得到活性代谢产物。
[0013]分离时，蛋白质纯化仪上所用凝胶柱优选为Superdex75葡聚糖凝胶柱。
[0014]抗肿瘤小分子的分离纯化:将拟诺卡氏放线菌NX032置于发酵培养基中，在28-30°C，160 — 170rpm/min 条件下，振荡培养 10-12 天后，以 8000 — 12000rpm/min 离心 15-20min，收集发酵上清液;将大孔吸附树脂DM301用甲醇浸泡12h-18h，无菌水洗脱至无味、pH值至中性后，将大孔吸附树脂与发酵上清液以1: 2.5-1:3体积比混合，4°C静置放置24h-30h，收集100 %甲醇解析溶液，冷冻干燥，得到粗提物。
[0015]进一步用高效液相色谱仪分离纯化时的条件:柱子型号:ZORBAX SB-C189.4X150mm 5um，流动相:水、乙腈，流速:lmL/min，上样量:20yL，运行方法:O-1Omin水:乙腈60%-40%、10-13min水:乙腈0-100%。
[0016]目前，色谱技术已被大量应用于细菌代谢产物的分离与分析，如RobertJ.Capon等从拟诺卡氏菌Nocard1psis sp.(CMB-M0232)中利用液相色谱分离得到I个新的3，6_二取代的a_卩比喃酮类化合物Nocard1pyrone A, Johannes F.1mhoff课题组从拟诺卡氏菌Nocard1psis strain HB383,并利用液相色谱从菌株的发酵液中分离得到4个新2,5-二取代的y_吡喃酮类衍生物:NocapyronesA-D。虽然色谱技术运用很频繁，但由于涉及的菌种不同和得到的活性物质不同，分离条件也就各不相同。
[0017]利用以上分离纯化方法所得拟诺卡氏放线菌NX032的代谢产物，经LC-MS/MS抗肿瘤活性鉴定，证明:具有较好的抗肿瘤活性。
[0018]本发明在改进分离纯化的基础上得到具有抗肿瘤活性的小分子和蛋白质，其活性物质具有广谱的抗肿瘤活性，对多种肿瘤细胞如Hep-3B(人肝癌细胞)、B16(小鼠黑色素瘤细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)均有细胞毒性，且活性较好，同时对正常细胞的毒性较低。且对其抗肿瘤机制进行了初步研究，并发现从拟诺卡氏放线菌分离得到的ATP synthasesubunit a具有抗肿瘤活性。
[0019]本发明的研究对象是拟诺卡氏菌属放线菌，它在各种环境中广泛分布，尤其在中度和高度盐环境中表现出了优势菌群的特征。虽然高盐环境中产生新的活性次级代谢产物的放线菌的探索较少，但是高盐放线菌中己经发现很多新的活性次级代谢产物，表明这种生态环境的放线菌在产生新的活性化合物方面具有很大的潜力。
[0020]拟诺卡氏菌株活性产物因其结构独特与多样化、生物活性较好的次生代谢产物，会成为未来天然产物研究的潜在对象。尤其是在盐碱和海洋环境釆集、分离得到的拟诺卡氏菌株，不仅能够产生新化合物，而且数量较多，是不可多得的微生物来源天然产物开发菌株。本发明中通过土壤筛选到了一株拟诺卡氏放线菌，通过AKTA PurifierlO和高效液相色谱技术分离得到具有广谱抗肿瘤活性的蛋白质和小分子化合物并对其抗肿瘤机理进行初步研究。有助于丰富拟诺卡氏菌属抗肿瘤活性的天然产物，为探索抗肿瘤作用机理提供理论基础，为创新药物研究提供新的材料，为获得结构新颖的化合物提供菌株资源。
【附图说明】
[0021]图1是菌株Nocard1psis sp.NX032分离纯化后在TSB培养基上的形态特征图；
[0022]图2是菌株Nocard1psissp.NX032经分离纯化后的革兰氏染色形态特征图；
[0023]图3是菌株Nocard1psissp.NX032经分离纯化后的扫描电镜形态特征图；
[0024]图4是拟诺卡氏放线菌NX032菌株生长曲线图；
[0025]图5是Nocard1psis sp.NX032发酵上清液对不同肿瘤细胞活性的影响图；图中a、e为Hep_3B(人肝癌细胞)，b、f为B16(小鼠黑色素瘤细胞)，c、g为Hela(人宫颈癌细胞)，d、h为HUVEC(人脐静脉内皮细胞:正常细胞)，其中a、b、c、d为实验组，e、f、g、h为对照组；
[0026]图6是不同温度处理后的无菌发酵上清液对B16细胞毒性的影响图(图中a-e为发酵上清液分别经400C、60 °C、80 °C、90°C、100 °C处理后作用于B16的影响图；f为未经加热处理发酵上清液作用于B16的影响图)；
[0027]图7是不同pH处理后的无菌发酵上清液对B16细胞的毒性影响图(图中a-f为发酵上清液分别经PH2、4、6、7、1、12处理后作用于BI 6);
[0028]图8是无菌发酵上清液经不同浓度硫酸铵沉淀后收集的沉淀对B16细胞的毒性影响图(图中A为对照组，B为30 %硫酸铵沉淀蛋白，C为50 %硫酸铵沉淀蛋白，D为80 %硫酸铵沉淀蛋白);
[0029]图9是AKTA PurifierlO对硫酸铵粗提物的分离纯化图；
[0030]图10是抗肿瘤蛋白组分A对B16细胞抗肿瘤活性测定图；
[0031 ] 图11是AKTA PurifierlO对硫酸铵粗提物A的SDS-PAGE的纯度检测图；
[0032]图12是AKTA PurifierlO分离纯化的活性组分A对Hep_3B、Hela、B16和HUVEC细胞的活性的MTT检测图；
[0033]图13是发酵上清液经大孔吸附树脂DM301初步纯化后在Agilent 1290 Infinity上的分离图；
[0034]图14是分离得到的各单峰抗肿瘤活性测定图；
[0035]图15 是 Agilent 1290Infinity 分离活性组分 Peakl 对 Hela，B16，Hep_3B 和 HUVEC 细胞活性的MTT测定图；
[0036]图16是抗肿瘤蛋白物质A质谱鉴定结果图；
[0037]图17是抗肿瘤小分子Peakl质谱鉴定结果图；
[0038]微生物保藏情况说明
[0039]拟诺卡氏放线菌NX032(Nocard1psis sp.NX032)，该菌种于2015年6月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址:中国武汉武汉大学)，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2015361。
【具体实施方式】
[0040]以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0041 ] ①本实施例之拟诺卡氏放线菌NX032(Nocard1psis sp.NX032)，该菌种于2015年6月8日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址:中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为CCTCC N0:M 2015361。
[0042]②本实施例之拟诺卡氏放线菌NX032菌株分离过程:从湖南稻田地采集土样，取土壤样品Ig，放入装有玻璃球的锥形瓶中，加入99ml的无菌水，振荡20min。将处理后的土壤悬浮液成10倍系列稀释，分别稀释13倍、14倍、15倍，最终配成10—3、10—4、10—5稀释度悬浮液。分别吸10yL于高氏一号平板上，涂布均匀，倒置于28-30°C恒温培养箱中培养6天，反复纯化，最后在每个平板上挑出放线菌的菌落接种到高氏一号斜面上，28-30°C培养6天，常规涂片，石炭酸复红染色镜检。挑选纯化后的放线菌单菌落于含有30mL无菌种子培养基(TSB)的三角瓶中，置于摇床28-300C，280r/min培养4天。50%甘油混匀，-80°C冰箱中长期保藏。
[0043]③光学显微镜和扫描电镜观察:
[0044]具体实施过程:取拟诺卡氏放线菌NX032(Nocard1psis sp.NX032)培养2天的菌液1.5mL，10000rpm/min，3min，离心，去上清，双蒸水清洗两遍，用200yL双蒸水重悬菌体，吸取1yL菌液滴于载玻片中央，采用革兰氏染色法对拟诺卡氏放线菌NX032进行染色，并在100倍油镜下观察菌体的形态。同时将其稀释为10—4悬浮液，涂布于TSB平板上，观察在TSB板上菌落形态。取菌液1.5mL，1000rpm/min，3min，离心，去上清，PBS缓冲液洗涤8_10次，戊二醛40C过夜固定，分别用体积浓度30 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、100 %的乙醇每隔5分钟清洗一遍，取50yL菌液涂布于盖玻片上，在扫描电子显微镜下观察菌体形态。
[0045]图1、图2和图3是菌株Nocard1psis sp.NX032经分离纯化后的形态特征图。其中图1是TSB板上菌落形态图。图2是光学显微镜图，结果显示该菌株为长，中等分枝，直或Z字型。图3是扫描电镜图。
[0046]④Nocard1psissp.NX032菌株 16S rRNA基因同源序列分析:
[0047]具体实施过程:从TSB平板上挑取单菌落，转接到含有50mLTSB液体培养基中，28-30°C，160rpm/min，振荡培养2天后，使用细菌基因组DNA提取试剂盒，按操作步骤进行全基因组提取。根据细菌16S rRNA基因序列设计通用引物(Bf-F，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ； Bf-R，ACGGCTACCTTGTTACGACTT)并由生工(上海)生物技术有限公司合成。
[0048]按以下反应体系和反应条件进行16SrRNA基因扩增:
[0049]反应体系(20yL):无菌双蒸水12yL;5XBuffer 4yL；dNTP 1.6yL；Bf-R(1yM)0.6μL;Bf_F(10yM)0.6yL;基因组模板lyL;Primer star DNA Polymerase 0.2yL；
[0050]反应程序:预变性94°C4min，变性94°C30s，退火52°C30s，延伸72°C90s，30次循环，延伸 72°C10min。
[0051 ] PCR产物经多功能DNA纯化回收试剂盒纯化，与适量引物一起送交上海英骏生物技术有限公司测序。测序结果显示分离菌株Nocard1psis sp.NX032的16S rRNA基因序列长度为1524bp。将测得的Nocard1psis sp.NX032的16S rRNA基因序列，与在美国国家生物技术信息中心(NCBI ,http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中Blast比对。不同菌种的 16S rRNA基因序列进行同源性比对分析，结果显示该菌株属于拟诺卡氏放线菌属，分别与Nocard1psis sp.AF-333(FJ481931.l)^Nocard1psis sp.FXJ6.077(GU002080.I)、Streptomyces sp.Ahbb4KM214828.1、Nocard1psis dassonvillei subsp.dassonvilleistrain NRRL B_16366(AY999914.2)、Nocard1psis sp.AM8(AM236241.I)、Nocard1psissp.An26AM039886.1 ^Nocard1psis sp.87H32-3EU196476.1等的相似性最高，均为99 %。根据BLAST所得结果推测该菌株属于Nocard1psis sp.亚种，命名为Nocard1psis.sp NXO32并构建系统发育树(Repl icat1ns = 1000，Bootstrap值取百分比)。
[0052]⑤Nocard1psis sp.NX032的生长曲线测定:
[°°53] TSB培养基:5.0g氯化钠，17g胰蛋白胨，3g大豆蛋白胨，2.5g磷酸氢二钾，2.5g葡萄糖，加水定容至lL，pH 7.3;
[0054]具体实施过程:从TSB平板上挑取单菌落，转接到30mLTSB液体培养基中，28-300C，160rpm/min，振荡培养2天后，按2%转接于50mL TSB培养基中，28-30°C，160rpm/min，振荡培养，每6h取样，测定OD6OQ值。
[0055]Nocard1psis sp.NX032菌株生长曲线如图4所不，Nocard1psis sp.NX032的生长延滞期约为24h，30-48h为指数增长期，48-60h为稳定期，60h后为衰亡期。生长曲线测定结果说明Nocard1psis sp.NX032菌株的生长周期与已知拟诺卡氏放线菌生长周期基本一致，同时参照其生长周期可知该菌株在指数期其活性最好，故选择在此时间段接种发酵培养基。
[0056]⑥Nocard1psis sp.NX032菌株的抗肿瘤活性测定:
[0057]具体实施过程:取Nocard1psis sp.NX032菌株10-12天发酵液(10-12天发酵液的获取方法与生长曲线测定时的菌株培养方法一致)于冷冻离心机中(1000rpm)离心15mim，过0.22μπι滤膜，得到无菌发酵上清液。将小鼠黑色素瘤细胞B16以14个/每孔的数目(ΙΟΟμL)分别铺于96孔板中，置于37°C,5%CO2细胞恒温培养箱中静置培养24h，使细胞贴壁生长。分别加入2、5、1、15yL的无菌发酵上清液，和经40 0C、60 °C、80 °C、90 °C、100 °C处理Ih后的无菌发酵上清液10此；同时取无菌发酵上清液分别经?財弟度2、4、6、7、10、12处理11!后调?!1至中性，各加入1yL用于抗肿瘤试验。另设对照组(对照即CK，加未接菌种培养10-12天的发酵上清液)。温度处理和PH处理10-12天发酵上清液是独立且互不干扰的两个实验，目的是分别探究温度和pH对10-12天发酵上清液中抗肿瘤活性物活性的影响。对照组和无菌发酵上清液各设3个重复，继续培养24h。用倒置显微镜观察肿瘤细胞变化。对Hep-3B(人肝癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、HUVEC(人脐静脉内皮细胞:正常细胞)作同样的实验。
[0058]图5是5yL无菌发酵上清液分别对Hep_3B(人肝癌细胞)、B16(小鼠黑色素瘤细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、HUVEC(人脐静脉内皮细胞:正常细胞)细胞的毒性影响图，图中a、e为Hep-3B(人肝癌细胞)，b、f为B16(小鼠黑色素瘤细胞)，c、g为Hela(人宫颈癌细胞)，d、h为HUVEC(人脐静脉内皮细胞:正常细胞)，其中a、b、c、d为实验组，e、f、g、h为对照组。
[0059]图6是不同温度处理后的无菌发酵上清液对B16细胞毒性的影响图(图中a-e为发酵上清液分别经400C、60 °C、80 °C、90°C、100 °C处理后作用于B16的影响图；f为未经加热处理发酵上清液作用于B16的影响图)。
[0060]图7是不同pH处理后的无菌发酵上清液对B16细胞的毒性影响图(图中a-f为发酵上清液分别经PH2、4、6、7、1、12处理后作用于BI 6的影响图)。
[0061 ] 研究结果显示，Nocard1psis sp.NX032发酵上清液在5yL发酵上清液处理下能使Hep-3B(人肝癌细胞)、B16(小鼠黑色素瘤细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、HUVEC(人脐静脉内皮细胞:正常细胞)细胞皱缩变圆(参见图5)。不同温度处理下的无菌发酵上清液对肿瘤细胞毒性没有明显差异，都具有较强的细胞毒性，都能使B16细胞皱缩变圆以致裂解(参见图
6) ο
[0062]在强酸处理下抗肿瘤活性物的活性与中性条件下的抗肿瘤活性物的活性相比，其活性几乎丧失；强碱处理后的抗肿瘤活性物活性与强酸处理相同，其活性降低(参见图7);由此可推测发酵上清液中的抗肿瘤活性物为耐高温但不耐酸碱的物质。
[0063]⑦AKTA PurifierlO分离活性组分A的抗肿瘤实验和3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝(MTT)测定:
[0064]活性组分Al的制备:12，000rpm收集Nocard1psissp.NX032 10-12天发酵上清液，在500ml上清液中加入固体硫酸铵(缓慢加入，边搅拌边加入)，至混合物中硫酸铵的质量浓度为30 %，4°C静置4h，离心9000-12000rpm收集沉淀。将上清液加入固体硫酸铵至混合物中硫酸铵的质量浓度为50 %，离心收集沉淀。再在上清液中加入固体硫酸铵，至混合物中硫酸铵的质量浓度为80%，离心收集沉淀。分别将收集到的30%、50%和80%硫酸铵沉淀用水复溶，用截流分子量为3.5KD规格的透析袋去除盐离子后得到粗提蛋白。利用Superdex75葡聚糖凝胶色谱柱在蛋白质纯化仪上对粗提蛋白进行分离，(分离条件:流动相:水，流速:lmL/min，上样量:lmL，运行方法:100%水，运行时间:30min)，收集获得的活性组分A;并对其纯度进行SDS-PAGE检测。
[0065]具体实施过程:将Hep_3B(人肝癌细胞)、HeIa(人宫颈癌细胞)和B16(小鼠黑色素瘤细胞)和HUVEC(人脐静脉内皮细胞:正常细胞)细胞分别以14个/每孔的数目接种于96孔板，置于37°C、5 %⑶2细胞恒温培养箱中培养，使细胞贴壁生长，培养24h;分别加入不同浓度室温活性组分A，继续培养24h(每组设置3个重复)；对照组不加活性组分A继续培养24h;吸去上清，加入90yL新鲜RPM1-1640培养基，再加入1yL MTT试剂，继续培养4h;吸去上清，每孔加入I 1yL Formazan溶解液，放置1min，间隔震荡使结晶物充分溶解(MTT试剂与Formazan溶解液见光易分解，以上步骤避光操作)，置于酶联免疫检测仪上测量490nm处各孔的吸光值，并计算细胞存活率。
[0066]将收集到的样品A冷冻浓缩后，12%胶浓度进行SDS-PAGE检测。观察蛋白条带大小。
[0067]图8是无菌发酵上清液经不同浓度硫酸铵沉淀后收集的沉淀对B16细胞的毒性影响图(图中A为对照组，B为30 %的硫酸铵沉淀的蛋白，C为50 %的硫酸铵沉淀的蛋白，D为80%的硫酸铵沉淀的蛋白)；
[0068]图9 AKTA PurifierlO对硫酸铵粗提物的分离纯化；
[0069]图10是抗肿瘤蛋白组分A对B16细胞抗肿瘤活性测定图；(A是对照CK，即不加活性组分A处理，培养24h后B16细胞的形态图；B是加入活性组分A培养24h后B16细胞的形态图)
[0070]图11 AKTA PurifierlO对硫酸铵粗提物A的SDS-PAGE的纯度检测。
[0071]图12 AKTA PurifierlO分离纯化的活性组分A对Hep_3B、Hela、B16和HUVEC细胞的活性的MTT检测。MTT结果显示，活性组分A对Hela，B16，Hep-3B和HUVEC细胞都有活性，并且当浓度达到105.584yg/mL时，三种肿瘤细胞的抑制率都达到或接近50 %，而正常细胞的抑制率低于25%，其中该活性物对B16细胞的毒性最好(参见图12)。细胞抑制率计算公式如下:
[0072]抑制率=[(ODCK-OD调零)_ (OD 样品-OD调零)]/ (0DCK-0D 调零)
[0073]ODCK:正常培养的细胞；
[0074]OD调零:只加培养基不加细胞；
[0075]OD样品:正常培养的细胞加样品处理。
[0076]⑧Nocard1psis sp.NX032抗肿瘤小分子活性物的色谱分离和活性物MTT检测:
[0077]具体实施过程:12000rpm/min收集Nocard1psissp.NX032 10-12天发酵上清液，100%甲醇过夜活化DM301大孔吸附树脂，活化树脂经无菌水洗脱至无味，pH值至中性后将大孔吸附树脂与发酵上清液以1: 3体积比混合，4°C静置24h，收集100%甲醇解析溶液，12000rpm/min离心，过0.22μηι滤膜，利用高效液相色谱仪(Agi lent 1290Inf inity)进一步分离抗肿瘤活性物(柱子:Z0RBAX SB-C18 9.4 X 150mm 5μηι，流动相:水、乙腈，流速:ImL/min，上样量:20yL，运行方法:O-1Omin水:乙腈60%-40%、10_12min乙腈 100%。
[0078]图13是发酵上清液经DM301大孔吸附树脂后，取水相在Agilent 1290 Infinity上的分离；图14是制备得到的单峰的活性测定，Peakl和Peak2组分在Agilent 1290 Infinity上分离得到的各单峰经冷冻干燥浓缩仪冷冻干燥后，取20yL CldH2O复溶，13000rpm离心30min后，过0.22μπι膜获得无菌各单峰收集液，各取1yL作用于B16细胞24h，观察细胞的形
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[0079]图15 是 Agilent 1290Infinity 分离活性组分 Peakl 对 Hela，B16，Hep_3B 和 HUVEC 细胞活性的MTT测定。MTT结果显示，活性组分Peakl对Hela，B16，Hep-3B和HUVEC细胞都有活性，并且当10yL细胞培养液中加入72.536yL Peakl时，三种肿瘤细胞的抑制率都超过50%，而正常细胞的抑制率维持在25%左右。
[0080]⑨Nocard1psis.spNX032抗肿瘤活性物的LC-MS/MS鉴定:
[0081]具体实施过程:抗肿瘤蛋白胶内酶解质谱鉴定:准备无菌的1.5mEP管，用锋利的无菌针头切割下目的条带。加入280yL100mM NH4HCO3和120yL的30%乙腈脱色，室温放置至胶块无色透明，倒掉上清，冻干；加入90yL100mM NH4HCO3, 1yL 10mM 01'1'，56°(:孵化301^11，还原蛋白质；去上清，加入10yLlOO %ACN，5min后吸去；加入70yL100mM NH4HCO3，30yL 200mMIAA，暗处20min ；去上清，加入10yL 10mM NH4HCO3，室温15min；去上清，加入100%乙腈100V-L，5min后吸去，冻干;冻干后加5yL 1ng Trypsin溶液，置于4°C冰箱30_60min，使胶块充分膨胀;再加入适量的50mM碳酸氢铵缓冲液(无Trypsin)，pH 7.8_8.0。37 °C反应20小时左右;收集蛋白酶解液至新的离心管中，原管加入10yL 60 %乙腈/0.1 %三氟乙酸，超声3次，每次15min，吸出溶液并入前次溶液。合并冻干后置于-80 °C冰箱备用。结果见图16，经质谱鉴定该蛋白为ATP synthase subunit aD
[OO82]抗肿瘤小分子质谱鉴定:将从Aglient 1290上收集得到的抗肿瘤小分子，进行冷冻干燥浓缩，取10yL进行LC-MS/MS鉴定。检测离子源为正离子，质谱结果显示Peak I分子量为 158.03KDa(见图 17)。
【主权项】
1.一种拟诺卡氏放线菌，其特征在于，是拟诺卡氏放线菌NX032，jVocart/1jOsissp.NX032，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2015361。2.如权利要求1所述拟诺卡氏放线菌活性代谢产物的分离方法，其特征在于，包括以下步骤: 将拟诺卡氏放线菌NX032置于发酵培养基中，在28-30°C，160 — 170rpm/min条件下，振荡培养10-12天后，以8000 — 12000rpm/min离心15-20min，收集发酵上清液，过0.22μπι滤膜，得到无菌发酵上清液;在蛋白质纯化仪上进行初步分离，收集具有生物活性的组分;利用高效液相色谱仪进一步分离纯化，得到活性代谢产物。3.根据权利要求2所述的拟诺卡氏放线菌活性代谢产物的分离方法，其特征在于，初步分离时，蛋白质纯化仪上所用凝胶柱为Superdex 75葡聚糖凝胶柱。4.根据权利要求2或3所述的拟诺卡氏放线菌活性代谢产物的分离方法，其特征在于，进一步分离纯化时，所述高效液相色谱仪中所用色谱柱为C18反相色谱柱。5.如权利要求1所述拟诺卡氏放线菌在抗肿瘤方面的应用。6.如权利要求2— 4之一所分离的拟诺卡氏放线菌活性代谢产物在抗肿瘤方面的应用。
【文档编号】C07K1/36GK106047751SQ201610390105
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】丁学知, 夏立秋, 左明星, 胡胜标, 孙运军, 余子全, 黄伟涛, 胡益波
【申请人】湖南师范大学