专利名称：一株耐铅的产碱菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产碱菌及其应用。
背景技术：
伴随着城市化进程的加快和工农业的迅速发展，重金属的开采、冶炼、加工造成的污染主要表现在水污染中。2011年4月初，我国首个“十二五”专项规划一《重金属污染综合防治“十二五”规划》获得国务院正式批复，防治规划力求控制汞、镉、铬、铅及砷5种重金属。铅污染源主要来自于化妆品、蓄电池、五金等，可通过饮用水、食物、皮肤等渠道进入人体和动物组织中并积累，引起贫血症、神经机能失调和肾损伤。铅对水生生物的安全浓度为O. 16mg/L，人体内正常的铅含量应该在O. lmg/L。铅对人体的毒害作用具有潜伏性和长期性的特点，而且铅中毒事件的不断发生，有关铅污染及铅毒害的研究越来越受到国内外 学者的重视。在含重金属废水的处理技术中，传统去除方法有化学沉淀法、电解法、离子交换法、膜分离法和活性炭吸附法，这些方法一股只适用于重金属离子含量较高的情况，当重金属离子浓度较低(< 100mg/L)时，传统处理方法或是费用昂贵或是吸附效率不高，在应用上受到限制。生物修复法在处理低浓度重金属废水时具有成本低、去除率高、反应速度快、易再生、无二次污染、操作简便等优点，是一种具有广阔前景的新技术。微生物去除铅污染主要是借助其生化反应来清除或稳定环境中的有害铅，根据原理不同可分为生物还原沉淀、生物甲基化和生物吸附3种，生物还原沉淀适用于硫酸还原菌将硫酸根还原为HS_，再与铅生成不溶性的Pb2S。生物甲基化是利用微生物将环境中的重金属甲基化，使其更容易蒸发。生物吸附是利用细菌细胞和藻类来吸附环境中的有害物质。
发明内容
本发明的目的是为了提供一株耐铅的产碱菌及其应用。本发明的一株耐铅的产碱菌为产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年12月24日，保藏编号为CGMCC No. 7037。本发明产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1为革兰氏阴性菌，该菌株单菌落直径小于1mm，圆形，表面光滑湿润，乳白色半透明状，边缘整齐，菌苔颜色乳白色偏黄。该菌株单细胞球状或杆状，两端钝圆，周生鞭毛(如图1所示)。参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对产碱菌(Alcaligenessp.)BAPb.1进行生理生化鉴定产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1革兰氏染色试验呈阴性，能够利用柠檬酸盐，能够以蛋白胨为底物产氨，能够液化明胶，不能利用D-甘露糖，甲基红实验阳性，V-P实验呈阳性。本发明的耐铅的产碱菌作为吸附剂用于吸附低浓度铅污染废水中的Pb2+。本发明包括以下有益效果
本发明提供的产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1,具有培养条件简单,繁殖快的优点。本发明的耐铅的产碱菌在处理低浓度铅污染废水的过程中具有去除率高、反应速度快、无二次污染、操作简便等优点。采用干菌粉作为重金属吸附剂具有更易保存、使用方便、使用量小等优点，另外还具不受重金属毒性影响的优势。本发明产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1属于产碱菌属(Alcaligenes),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年12月24日，保藏编号为CGMCC No. 7037。
图1 为产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb. 1 放大 40000 倍的 TEM 图片；图2为吸附Pb2+后的产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1放大40000倍的TEM图片;图3为产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1的生长曲线；图4为产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1的吸附剂用量，pH值与吸附容量的交互关系;图5为产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1的吸附剂用量，Pb2+初始浓度与吸附容量的交互关系；图6为产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1的pH值，Pb2+初始浓度与吸附容量的交
互关系;图7为产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1菌株吸附Pb2+前的IR光谱图；图8为产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1菌株吸附Pb2+前后的IR光谱图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的一株耐铅的产碱菌为产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb. 1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年12月24日，保藏编号为CGMCC No. 7037。本实施方式产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1为革兰氏阴性菌，该菌株单菌落直径小于1mm，圆形，表面光滑湿润，乳白色半透明状，边缘整齐，菌苔颜色乳白色偏黄，该菌株单细胞球状或杆状，两端钝圆，周生鞭毛(如图1所示)。参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对产碱菌(Alcaligenessp.)BAPb.1进行生理生化鉴定产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1革兰氏染色试验呈阴性，能够利用柠檬酸盐，能够以蛋白胨为底物产氨，能够液化明胶，不能利用D-甘露糖，甲基红实验阳性，V-P实验呈阳性。本实施方式提供的产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1,具有培养条件简单,繁殖快的优点。本实施方式的耐铅的产碱菌在处理低浓度铅污染废水的过程中具有去除率高、反应速度快、无二次污染、操作简便等优点，干菌粉作为重金属吸附剂具有更易保存、使用方便、使用量小等优点，另外还具不受重金属毒性影响的优势。
具体实施方式
二本实施方式的耐铅的产碱菌作为吸附剂用于吸附低浓度铅污染废水中的Pb2+。通过以下试验验证本发明的有益效果试验1、菌株筛选本发明的耐铅的产碱菌是通过以下步骤筛选得到的从铅矿采集的土样中分离细菌，将分离得到的细菌进行耐铅试验。首先在含铅浓度分别为100mg/L，300mg/L，600mg/L固体LB培养基上筛选，然后进行适应性培养，挑取在固体培养基上生长并经过纯化的单菌落到5mL液体培养基，30°C，培养振荡12h以上，取
O.5mL菌液接种到25mL铅含量为50、100mg/L液体培养基中，通过观察菌液浑浊程度来终止培养。若浑浊，继续接种在铅含量为200mg/L的液体培养基中，以此类推，直到菌液不再浑池，以得到产喊菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1 试验2、菌株鉴定对筛选得到的产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1进行生理生化鉴定和分子鉴定。2.1生理生化鉴定本试验产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1为革兰氏阴性菌，该菌株单菌落直径小于1mm，圆形，表面光滑湿润，乳白色半透明状，边缘整齐，菌苔颜色乳白色偏黄，该菌株单细胞球状或杆状，两端钝圆，周生鞭毛(如图1所示)。参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对产碱菌(Alcaligenessp.)BAPb.1进行生理生化鉴定产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1革兰氏染色试验呈阴性，能够利用柠檬酸盐，能够以蛋白胨为底物产氨，能够液化明胶，不能利用D-甘露糖，甲基红实验阳性，V-P实验呈阳性。2. 2分子鉴定对上述试验筛选得到的产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1进行分子鉴定，按以下步骤进行利用引物16F和16R，进行PCR扩增，基因扩增产物经纯化后委托北京华大基因公司测序；其中，PCR扩增引物序列如下16F 5/ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16R 5/ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR 扩增条件为94°C预变性 5min，94°C变性 lmin，58°C退火 45s，72°C延伸 lmin，30个循环；72°C终延伸IOmin。产喊菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1的16SrDNA序列长度为1426bp,其序列提交至GenBank获得的登录号为KC337149，测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1的16SrDNA序列与产碱菌属(Alcaligenes)的16S rDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99%,综合生理生化特征和菌落形态特征,确定产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1属于产碱菌属(Alcaligenes)，已于2012年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No. 7037。PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司，其他试剂购自于大连宝生物工程有限公司。试验3、菌株生长曲线测定
3.1菌株富集将产喊菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1先在10mT, LB液体培养基中增殖16 20h,再接入IOOmL LB液体培养基，在温度为30°C，转速为160r/min的条件下摇瓶培养16 20h后，将菌体接入IOOOmL LB液体培养基，在温度为30°C，转速为160r/min的条件下摇瓶培养16 20h，然后在转速为8000r/min下离心lOmin，蒸馏水洗涤菌体2遍，置于75°C烘箱干燥后研磨成粉末状，得到富集的菌株。3. 2菌株生长曲线测定将富集的菌株按5%的接种量接入LB液体培养基，在温度为30°C，转速为160r/min的条件下培养，用紫外分光光度计测定不同时间点的0D_值，以0D_值为纵坐标，培养时间为横坐标绘制菌株生长曲线。产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1的生长曲线如图3所示,从图3可以看出，该菌 株生长迅速，延滞期较短；3 Ilh属于对数期，菌量呈指数生长；11 21h属于稳定期，活菌量稳定且有最大值，出现少量沉淀；21h之后属于衰亡期，活菌量迅速下降，有大量沉淀产生。试验4、菌株耐铅水平确定菌种按5%接种量分别接到含不同Pb2+浓度的LB液体培养基中摇瓶培养，结果表明在Pb2+浓度O 300mg/L时菌株生长良好，浓度300 400mg/L时，生长受到抑制，生长量有所下降，当浓度大于500mg/L时，生长完全被抑制。试验5、菌粉最佳吸附条件确定5.1Pb2+ 初始浓度配制Pb2+初始浓度分别为 10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L,pH 值为 5. 5的溶液，加入浓度为2mg/L的吸附剂，在转速为160r/min，温度为30°C的恒温摇床上震荡30mim，取溶液在10000r/min下离心后，取上清液，通过原子吸收光谱仪测定溶液中剩余Pb2+浓度。5. 2pH 值配制Pb2+初始浓度为100mg/L，pH值分别为3、4、5· 5、6、6· 5、7的溶液，加入浓度为2mg/L的吸附剂，在转速为160r/min，温度为30°C的恒温摇床上震荡30mim，测定溶液中剩余Pb2+浓度。5. 3吸附剂用量配制Pb2+初始浓度为100mg/L，pH值为5. 5的溶液，分别加入浓度为O. 5g/L、Ig/LU. 5g/L、2g/L、2. 5g/L、3g/L、4g/L、5g/L 的吸附剂，在转速为 160r/min，温度为 30°C 的恒温摇床上震荡30mim，测定溶液中剩余Pb2+浓度。5. 4 温度配制Pb2+初始浓度为100mg/L，pH值为5. 5的水溶液，加入浓度为2mg/L的吸附齐U，在转速为160r/min，温度分别为22°C、26°C、30°C、35°C的恒温摇床上震荡30mim，测定溶液中剩余Pb2+浓度。 5. 5 时间配制Pb2+初始浓度为100mg/L，pH值为5. 5的水溶液，加入浓度为2mg/L的吸附剂，在转速为160r/min，温度为30°C的恒温摇床上震荡，震荡时间分别为10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min,测定溶液中剩余 Pb2+ 浓度。按下列公式计算菌体对Pb2+的吸附率Q和吸附容量q (mg · g—1)Q = (C1-Cf) /Ci X 100 %q = (C1-Cf) /Cb式中Ci为吸附前溶液中的Pb2+质量浓度(mg/L) ；Cf为吸附后溶液中的Pb2+质量浓度(mg/L) ;Cb为吸附剂重量(mg/L)，M为吸附剂用量(mg/L)。产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1的吸附剂用量，pH值与吸附容量的交互关系如图4所示；产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb. 1的吸附剂用量，Pb2+初始浓度与吸附容量的交互关系如图5所示；产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1的pH值，Pb2+初始浓度与吸附容量的交互关系如图6所示；由图4、图5、图6可以得出，当条件为Pb2+初始浓度为100mg/L、pH为5.1、吸附剂用量为2g/L、温度为30°C、震荡时间为30min，转速为160r/min时，去除率和吸附容量均能达到较理想结果，去除率Q达82. 4%，吸附容量q达到60. 5mg/g。试验6、菌株吸附Pb2+机制分析取吸附前后的菌体进行透射电镜(TEM)观察和红外光谱(IR)分析。产碱菌(Alcaligenes sp. ) BAPb.1放大40000倍的TEM图片如图1所示，从图1可见，菌体两端钝圆，形态呈明显的多形性，周生鞭毛，菌体细胞表面包被一层不定型外被；吸附Pb2+后的产碱菌(Alcaligenes sp.) BAPb.1放大40000倍的TEM图片如图2所示;从图2可见；细胞表面不规则附着堆积大量具有衍射现象的电子不透明的小颗粒，表明BAPb.1能够大量吸附Pb2+，或将其还原为铅原子，或与胞外某些阴离子通过络合作用形成沉淀而聚集成电镜下可见的颗粒；由此可初步认为快速吸附的行为是由于Pb2+与菌体细胞表面某些分子或基团相互作用和结合。产碱菌(Alcaligenes sp. )BAPb.1菌株吸附Pb2+前的IR光谱图如图7所示，其中3307. 08CHT1处为羟基的最大吸收位置，2926. 06cm^处为烷基CH2的反对称伸缩吸收峰，1653. 55cm_1处为羧基的最大吸收峰，1057. 30cm_1处为C-O-C的吸收峰,699CHT1处为烯烃CH面外弯曲吸收峰；产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1菌株吸附Pb2+前后的IR光谱图如图8所示，其中3305. 09cm—1处为羟基的最大吸收位置，2925. 20cm—1处为烷基CH2的反对称伸缩吸收峰，1653. 85CHT1处为羧基的最大吸收峰，1054. 22cm^处为C-O-C的吸收峰，699cm-1处为烯烃CH面外弯曲吸收峰；从图7、图8可知，吸附Pb2+后，羟基的最大吸收位置从3307. 08cm-1迁移至3305. 09CHT1，吸收峰强度变大，峰形变窄；烷基CH2的反对称伸缩吸收峰2926. 06cm 1迁移至2925. 20cm 1 ;竣基的最大吸收峰从1653. 55cm 1迁移至1653. 85cm 1 ；C-O-C的吸收峰从1057. 30CHT1迁移至1054. 22CHT1，位于699CHT1处烯烃CH面外弯曲吸收峰强度变大；由此可见，菌株对Pb2+的吸附主要是通过细胞成分中的活性基团与Pb2+发生络合作用。
权利要求
1.一株耐铅的产碱菌,其特征在于耐铅的产碱菌为产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年12月24日，保藏编号为CGMCC No. 7037。
2.如权利要求1所述的一株耐铅的产碱菌的应用，其特征在于耐铅的产碱菌作为吸附剂用于吸附低浓度铅污染废水中的Pb2+。
全文摘要
一株耐铅的产碱菌及其应用，它涉及一株产碱菌及其应用。产碱菌(Alcaligenes sp.)BAPb.1，于2012年12月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CGMCC No.7037。一株耐铅的产碱菌作为吸附剂用于吸附低浓度铅污染废水中的Pb2+。本发明的菌株对Pb2+最高耐受浓度为500mg/L，在Pb2+初始浓度100mg/L、pH 5.1、温度25℃时，对Pb2+去除率达82.4％，吸附容量达到60.5mg/g。该菌株应用于低浓度铅污染废水的生物净化。
文档编号C02F1/28GK103013894SQ201310020859
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者曲娟娟, 金羽, 闫立龙, 赵媛媛, 顾海东 申请人:东北农业大学