专利名称：菊花抗逆转录因子DgZFP1及其植物表达载体和构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及菊花抗逆转录因子彻及其植物表达载体和构建方法及应用。
背景技术：
高盐、干旱和低温等非生物胁迫对作物的产量及生长发育有很大影响，因此，有关植物抗逆性的研究一直是植物学研究领域的热点之一。菊花原产我国，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，观赏和经济价值极高，在花卉生产中占有重要地位。但随着菊花设施栽培面积的不断增加，土壤盐渍化逐渐成为菊花周年供应的主要限制因素。目前的土壤改良措施存在着许多不足，同时巨大的水资源消耗也成为当前菊花产业发展的瓶颈。菊花抗逆育种一直是国内外园艺工作者致力的重要课题之一，鉴于抗逆性是一个多基因控制的数量性状，杂交育种等常规育种方法效率低。已有的研究表明，转高效抗逆调控基因的分子育种对提高植物抗逆性有积极作用。目前，在改良植物的抗逆性方面，人们利用多类转录因子做了很多的尝试。锌指蛋白是识别特定碱基序列的一种普遍性的转录因子结构，通过基因工程技术过量表达一些锌指蛋白可以提高植物对非生物胁迫的耐受能力，如Kim等(2001)将大豆锌指蛋白基因5T6F-7转入拟南芥和烟草，转基因植株的抗盐能力显著增强[1] ；Sugano等(2003)获得了锌指蛋白的转基因矮牵牛，增强了其耐干旱胁迫的能力[2] ；Mukhopadhyay等 (2004)将水稻锌指蛋白基因O /幼转入烟草，提高了烟草的对高盐的耐性[3]。在作物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将抗逆转录因子基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有耐逆特性的新种质。对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用具有重要意义。Yoo C-M, Lee Si, Chun HJ, Yun D-J, Hong JC, Lee SY, Lim CO and Cho MJ. (2001) A novel cold-inducible zinc-finger protein from soybean, SCOF-I, enhances cold tolerance in transgenic plants. Plant J. 25, 247 - 259SuganoS, Kaminaka H, Rybka Z, Catala R, Salinas J, Matsui K, Ohme-Takagi M, Takatsuji H. (2003) Stress-responsive zinc finger gene ZPT2~3 plays a role in drought tolerance in petunia. Plant J. 36(6)， 830 - 841.SakamotoH, Maruyama K, Sakuma Y, Meshi T, Iwabuchi M, Shinozaki K and Yamaguchi-Shinozaki K. (2004) Arabidopsis Cys2/His2-Type Zinc-Finger Proteins Function as Transcription Repressors under Drought, Cold, and High-SalinityStress Conditions. Plant Physiol. 136， 2734-2746
发明内容
解决的技术问题本发明为解决提高植物耐逆性的问题，提供一个新的菊花‘钟山紫桂’抗逆转录因子彻^^八本发明还提供该抗逆转录因子彻的植物表达载体及其构建方法和应用。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化，创制耐盐新种质，可用于植物品种改良。技术方案
菊花‘钟山紫桂’抗逆转录因子/^7^7，该基因的序列为SEQ ID NO. 1。菊花‘钟山紫桂’抗逆转录因子彻的植物表达载体，由本发明所述的菊花‘钟山紫桂’抗逆转录因子彻·^7/^与中间植物表达载体pCAMBIA 1301构成。菊花‘钟山紫桂’抗逆转录因子植物表达载体，其构建方法如下
1)菊花‘钟山紫桂’抗逆转录因子彻·屈P7的克隆
以提取的‘钟山紫桂’幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物扩增 DgZFPl 基因，
上游引物 DgZFPl-F: 5' - ATGGCAGTTGAAGCTCTAAACTCAC -3' 下游引物 DgZFPl-R: 5' - ATGTTGTGTCGGGATCTCGAGCTTT -3' 以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T Simple载体， 转化T0P10感受态细胞，进行序列测定；
2)植物表达载体pCAMBIAUQl-DgZFPl的构建
设计引物以菊花‘钟山紫桂’ cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在彻基因的上游和下游分别弓I入BamWI和
幻7/7 i酶切位点，
上游引物 DgZFPl-M-F: 5' - CGCGGATCCATGGCAGTTGAAGCTCTAAACTCAC -3' 下游引物 DgZFPl-M-R: 5' - CGGGGTACCATGTTGTGTCGGGATCTCGAGCTTT -3' PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒，I 和命1双酶切的彻片段与[和命I双酶切的pCAMBIA 1301连接，转化，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA UOl-DgZFPl构建成功。3 ) DgZFPl的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，提高植物抗盐性，方法如下
农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化； 拟南芥花序浸染及种子筛选； PCR鉴定及耐盐性评价。菊花抗逆转录因子彻在提高植物耐盐特性的应用有益效果
1.本发明提供的菊花‘钟山紫桂’ i汝^FW是一个新的抗逆转录因子，该基因可提高植物耐盐性。
2.本发明构建的菊花‘钟山紫桂’々§·Ζ/^7基因植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创制耐盐新种质，提高植物的耐盐抗性，可进行植物品种改良。
图1为DgZFPl琼脂糖凝胶电泳分析，图中 M:DNA Marker
1 -.DgZFPl ；2 :pMD19-T Simple-^Z/^7 质粒汉·Η I 和^w I 双酶切； 3 :pCAMBIA UQl-DgZFPl表达载体及拙H 1和幻7/ I双酶切检测图； 图2 植物表达载体pCAMBIA UQl-DgZFPl图谱； 图3野生型与转基因拟南芥PCR鉴定； 图4野生型与转基因拟南芥抗盐性评价。
具体实施例方式植物表达载体pCAMBIA 1301_i汝的构建
1.DgZFPl的克隆
选用菊花‘钟山紫桂’作为材料，选取健康的插条，扦插成活的幼苗(20天)于200mM NaCl连续胁迫处理7天，取0. 05g幼嫩叶片，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书方法，提取叶片总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取1 μ g总RNA反转录成 cDNA, M RNase cDNACapsicum annuum 白勺 cys2/his2_type zinc finger
transcription factor序列信息(NCBI登录号AY196704)，经Primer 5软件分析设计引物 ψ 箄 DgZFPl ；
上游引物 DgZFPl-F: 5' - ATGGCAGTTGAAGCTCTAAACTCAC -3' 下游引物 DgZFPl-R: 5' - ATGTTGTGTCGGGATCTCGAGCTTT -3' 以提取的叶片cDNA为模板，进行PCR反应，
50 μ L 反应体系10XRCR Buffer 5.0 μ L，DgZFPl_F、DgZFPl_R 引物各 1. 0 μ L (20 μ mol · L-1)，dNTP mix 4. 0 μ L (2. 5 mmol · Γ1)，Taq DNA Polymerase 0. 2 μ L, cDNA 模板 1 yL，ddH20 37.8 “1^;反应程序95 °C预变性 4 min，然后 94 °C解链 30 sec, 55 °C 退火30 sec, 72 °C延伸1 min 30 sec，反应33个循环，72 °C延伸10 min;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19_T Simple载体 (TaKaRa)，转化T0P10感受态细胞，进行序列测定；
2.植物表达载体pCAMBIA1301-/^27^7的构建
设计引物进行PCR反应，在目的基因彻的上游和下游分别弓I入酶切位点Β』I和 Kpn I，PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒， I和Kpn I双酶切的DgZFPl片段与BanM 1和Kpn I双酶切的pCAMBIA 1301连接，转化，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证。上游引物DgZFPl-M-F: 5' -CGCGGATCCATGGCAGTTGAAGCTCTAAACTCAC -3'下游引物 DgZFPI-M-R 5' - CGGGGTACCATGTTGTGTCGGGATCTCGAGCTTT -3'①以菊花‘钟山紫桂，叶片cDNA作为模板，用高保真酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase，TaKaRa)进行 PCR 反应，50 yL 反应体系10XHS RCR Buffer 5. 0 μ L, DgZFP 1-M-F、DgZFPl-M-R 弓丨物各 1. 0 μ L (20 μ mol · L-1)，dNTP mix 4.0 μ L (2.5 mmol · L-1)，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 4 μ L, cDNA 模板 1 μ L, ddH20 37. 6 μ L ； 反应程序95 °C预变性4 min，然后94 °C解链30 sec, 55 °C退火30 sec, 72 °C延伸 1 min 30 sec，反应30个循环，72 °C延伸10 min ;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN， USA)回收，连接到pMD19-T Simple载体，转化TOPlO感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-T ^imvle-DgZFPl ；
②取载体pCAMBIA 1301 (Invitrogen, USA)禾Π pMD19_T Simple-i^Z/^7 用召afflH 和式Ot I 双酶切，双酶切体系(50 μ ) :10XH Buffer 5 μ , pMD19-T Simple-^Z/^7 15 μ , BamW I 2 μ , Kpn I 2 μ , ddH20 26 μ ； 37 °C 反应 3 h ；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pCAMBIA 1301大片段和pMD19_T Sixmle-DgZFPl小片段。用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应体系(10 μ ) =IOXT4 ligase Buffer 1 μ , pCAMBIA 1301 大片段 2 μ , pMD19-T Simple-i^Z/^7 小片段6 μ , T4 DNA连接酶1 μ ;16 °C过夜连接反应，取5 PL连接产物转化T0P10感受态细胞。37 °C过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pCAMBIA U价-DgZFPl,进行酶切和测序验证。植物表达载体pCAMBIA 1301-々§·Ζ/^7的构建成功。3.植物表达载体pCAMBIA 1301-々§·Ζ/^7遗传转化拟南芥及其耐盐性鉴定 ①农杆菌菌株ΕΗΑ105感受态制备及冻融法转化
从YEB (50 ug/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50 mL含50 ug/mL利福平的YEB液体培养基中，200 rpm, 28°C培养至OD值0. 5，而后冰浴菌液30 min,离心收集菌体，悬浮于2 mL预冷的的IOOmM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200 uL/管分装，待用。取10 uL pCAMBIA 1301-/^27^7载体质粒，加入200 uL感受态细胞，冰浴30 min, 液氮冷冻5 min,37°C 5 min，加入800 uL YEB液体培养基，28°C 200 rpm预培养4 h，菌液涂板于YEB (50 ug/mL利福平+ 50 ug/mL卡那霉素)固体培养基上，28°C暗培养2天， 挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。②拟南芥花序浸染及种子筛选
将阳性单克隆接到50 mL的YEB (50 ug/mL利福平+ 50 ug/mL卡那霉素)液体培养基中，培养24小时，5000 rpm离心20分钟，然后用转化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖， 调pH为5. 8，然后加200uL/L的Silwet L-77混合)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养12小时，打开保鲜膜，待种子成熟时采收。种子消毒与播种将种子放入1. 5mL的离心管中，加入ImL 75%酒精，添加0. 1%的 Triton X-100摇晃15分钟，然后在超净台中用95%的酒精洗两次，而后直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上，以吹干种子(放置30分钟)，轻轻敲击滤纸将干种子均勻撒播到筛选培养基上(1/2MS + 20mg/L草胺磷+ 25mg/L氨苄青霉素)筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗1周以保湿。
③PCR鉴定及耐盐性评价 待抗性苗7 8片叶，提取拟南芥叶片DNA，进行PCR(引物DgZFPl-F和DgZFPl-R)鉴定 (图3)。经PCR鉴定的T1代转基因苗继续生长，采收T2代种子。对野生型和T2代抗性转基因拟南芥进行盐处理14天后比较抗盐性(200 mM NaCl)，发现转基因拟南芥(J)gZFPl_12) 成活率高于野生型拟南芥(图4)。
综上所述，本发明构建了含有抗逆转录因子的植物表达载体pCAMBIA 1301-々§·Ζ/^7，其印DgZFPl为首次报道。所构建的载体可导入植物中，提高植物的耐盐性。
权利要求
1.菊花抗逆转录因子/^7/^7，其特征在于该基因的序列为SEQID NO. 1。
2.菊花抗逆转录因子基因植物表达载体，其特征在于由权利要求1所述的菊花 ‘钟山紫桂’抗逆转录因子与植物表达载体构成。
3.根据权利要求2所述的菊花抗逆转录因子基因植物表达载体，其特征在于所述的植物表达载体为I和幻μ I双酶切后插入到表达载体pCAMBIA 1301质粒进行重组反应得到。
4.权利要求3所述的菊花抗逆转录因子植物表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)菊花‘钟山紫桂’抗逆转录因子 屈P7的克隆以提取的‘钟山紫桂’幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物扩增 DgZFPl 基因，上游引物 DgZFPl-F: 5' -ATGGCAGTTGAAGCTCTAAACTCAC-3’下游引物 DgZFPl-R: 5' -ATGTTGTGTCGGGATCTCGAGCTTT-3‘以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T Simple载体， 转化T0P10感受态细胞，进行序列测定；2)植物表达载体pCAMBIAUQl-DgZFPl的构建设计引物以菊花‘钟山紫桂’ cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在基因的上游和下游分别弓I入BamWI和KpnI酶切位点，上游引物 DgZFPl-M-F: 5' - CGCGGATCCATGGCAGTTGAAGCTCTAAACTCAC -3'下游引物 DgZFPl-M-R: 5' - CGGGGTACCATGTTGTGTCGGGATCTCGAGCTTT -3'PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒，I 和命I双酶切的傲7/^7片段与i和知1双酶切的pCAMBIA 1301连接，转化，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA UOl-DgZFPl构建成功。
5.菊花抗逆转录因子在提高植物耐盐特性的应用。
全文摘要
菊花抗逆转录因子DgZFP1及其植物表达载体和构建方法及应用，本发明属于分子生物学领域。本发明所构建的表达载体pCAMBIA1301-DgZFP1是由DgZFP1基因插入到克隆载体pMD19-T simple vector(Takara)，经BamHI (Takara)和KpnI (Takara)双酶切后连接到载体pCAMBIA1301(Invitrogen)的BamHI和KpnI位点而得到的重组质粒。将该植物表达载体用于植物遗传转化，DgZFP1基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成DgZFP1蛋白，调控下游基因的表达，提高植物耐盐性。
文档编号C12N15/82GK102154320SQ20111003909
公开日2011年8月17日 申请日期2011年2月17日 优先权日2011年2月17日
发明者刘兆磊, 宋爱萍, 房伟民, 朱喜荣, 蒋甲福, 陈发棣, 陈素梅, 高海顺 申请人:南京农业大学