专利名称：一种野生大豆leafy类转录因子及其编码基因与应用的制作方法
一种野生大豆LEAFY类转录因子及其编码基因与应用 技术领域 本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及与植物早花相关的LEAFY类转录因子及其编码基因与应用，并涉及来源于野生大豆的与早花相关的LEAFY类转录因子GsLFY及其编码基因与其在培育早花植物品种中的应用。
背景技术：
野生大豆(Glycine soja)为一年生草本，属于豆科、蝶形花亚科大豆属，是栽培大豆的近缘野生种，在我国有着悠久的种植历史和丰富的品种资源。野生大豆具有高蛋白、多花多荚和抗病虫耐逆境等优质性状，可以为栽培大豆提供有用性状或基因源，拓宽了栽培大豆遗传背景，是重要的遗传资源。因此，野生大豆的资源利用越来越为育种家们所重视， 成为改良栽培大豆品质、提高大豆产量的重要种质资源。生殖生长是植物生长过程中重要的阶段，花的发育是这一阶段开始的重要标志。 成花过程不仅是植物生长发育中的重要转折时期，也是对农业生产产生直接影响的重要时期。这一过程受到基因网络的严格控制，伴随着一些特异基因的差异性表达。LEAFY基因家族是植物特有的、单一成员的转录因子基因家族。LEAYF编码的转录因子在拟南芥中控制花序分生组织向花分生组织转变，调控开花时间，同时它还能激活下游同源异形基因的表达参与花器官的形成。野生大豆LEAFY类转录因子及其编码蛋白的研究，有助于我们对开花机制的深入了解，实现利用基因工程手段控制花期。这不仅可以解决制种过程中的花期不遇的难题，也可以缩短育种时间加快育种步伐，在农业生产上也有助于合理安排茬口提高复种指数
发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种野生大豆LEAFY类转录因子及其编码基因与应用。技术方案本发明所提供的一种野生大豆LEAFY类转录因子，命名为GsLFY，来源于大豆属野生大豆(Glycine soja Sled, et Zucc.)，是具有序列表中的SEQ ID NO. 2所述氨基酸序列的蛋白质。上述的野生大豆LEAFY类转录因子的编码基因，其cDNA全长序列具有序列表中 foZ/T基因SEQ ID NO. 1的DNA序列；其中，序列表中的foZ/T基因SEQ ID NO. 1由1224个碱基组成，本序列为GsLFY的读码框，编码具有序列表中SEQ ID NO. 2的407个氨基酸残基序列的蛋白质。含有本发明foZ/T基因SEQ ID NO. 1的表达载体是指pMDC83_GsLFY植物过量表达载体，宿主菌是指将foZ/T转入的根癌农杆菌菌株EHA105。扩增foZ/T基因组全长的引物为
GsLFY sense:5，GGCGAATTCCCATGGATCCGGACGCA 3’ ； GsLFY antisense:5’ GGCTCGAGTCTAGATTTAGAAGGGAAGGTG 3’。扩增foZ/TcDNA全长的引物为 GsLFY-ORF sense
5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATCCGGACGCATTCA 3'； GsLFY-ORF antisense:
5’ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGAAGGGAAGGTGAGCACT 3’。实时荧光定量PCR分析中的扩增foZ/T引物为 GsLFY-qPCR sense 5’ ACAAGCCAAAGATGCGACACT 3’ ； GsLFY-qPCR antisense 5’ CGTTCTCCCCTCTCTCCTTGA 3，。上述野生大豆LEAFY类转录因子及其编码基因foZ/T可在培育早花植物中得到应用。有益效果=GsLFY可能参与野生大豆生殖发育的大部分进程。foZ/T在野生大豆的根、花以及发育后期的种子中特异性表达。35S::GsLFY转基因烟草与对照组烟草相比，开花期显著提前。这一结果说明foZ/T能够控制植物的成花转变过程，调控花期。过量表达该基因可促使植物的开花期提前。本发明的foZ/T对培育早花植物品种特别是早花早熟大豆具有重要意义，在作物育种发面具有广泛的应用前景。利用植物过量表达载体，将本发明的foZ/T导入植物体内，可获得提前开花的转基因植株。使用foZ/T构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、GFP基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。携带有本发明foZ/T的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物， 也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。
图1为GsLFY在野生大豆中的表达特性图
A. foZ/T在野生大豆不同器官中的表达分析。Rt，幼根；St，幼茎；Lf，叶片；Sa，茎尖； In，盛花；Sd，开花后21天的种子。B. foZ/T在野生大豆四轮花器官中的表达分析。Se，花萼；Pe，花瓣；St，雄蕊；Ca，心皮。C. foZ/T在野生大豆不同花发育时期的表达分析。Bd，花芽；Fd，花蕾；In，盛花。D. foZ/T在野生大豆不同发育时期(开花后10天、15天、20天、25 天、30天、35天、40天、45天、50天)的种子中的表达分析。
图2为含有GsLFY的植物过量表达载体的部分结构示意图
注此载体的构建过程中采用大肠杆菌株系DH5ci，转化烟草采用根癌农杆菌EHA105。图 3 为 35S: GsLFY 转基因烟草植株 LFYl、LFY3、LFY4、LFY5、LFY15、LFY39，LFY45 和对照组转基因烟草植株CK-I和CK-2中GsLFY的表达分析。图4为35S: GsLFY转基因烟草和转入pMDC83载体的烟草(control)的开花期比较。35S::GsLFY转基因植株平均开花期为移苗后141. 67天，对照组开花期大约为移苗后 170. 75 天，差异显著(*，P<0. 05)。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。(一)野生大豆GsLFY及其编码基因的克隆与鉴定
实验材料为野生大豆江浦野生豆-5 (何慧等，2009，大豆科学，28 (5) :784-790)，参照栽培大豆LEAFY基因(GenBank数据库中的cDNA序列登录号DQ448810，基因组DNA 序列登录号为DQ448809)的序列信息，利用生物信息学的方法进行分析，设计引物，进行野生大豆LEAFY基因的克隆，基因命名为GsLFY0扩增foZ/TcDNA全长的引物是 GsLFY-ORF sense
5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATCCGGACGCATTCA 3'； GsLFY-ORF antisense:
5’ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGAAGGGAAGGTGAGCACT 3’。应用RT-PCR的方法，从野生大豆花的cDNA中克隆GsLFY0取野生大豆的花，置于液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取总RNA用反转录试剂盒(Τ0Υ0Β0公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20mL PCR反应体系为ImL—链 cDNA (0. 05 μ g)、上下游引物各 ImL (10mM)、2mL 10XPCR 缓冲液、0. 4mL dNTP (IOmM)和IU Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20mL。反应在Bio-RAD PTC200型PCR仪上进行，其程序为94°C预变性5min ;94°C变性50 s，58°C退火50 s，72°C延伸lmin，共32 个循环；然后72°C延伸10 min; 4°C保存。PCR产物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物具有序列表中SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。foZ/T的ORF全长为1224bp，编码407个氨基酸。(二)野生大豆foZ/T在不同器官和不同发育时期的种子中的表达特征
以野生大豆品种一江浦野生豆_5为实验材料，利用实时荧光定量PCR技术，对GsLFY 在野生大豆各个器官和不同发育时期的种子中的表达情况进行了研究。野生大豆材料经过种脐背部切口处理后，于六月初播种于南京农业大学网室，苗期搭架。田间管理同常规。出苗后4周取根、茎、叶、茎尖；初花期取花芽；盛花期取花苞和盛花；取开花后10天、15天、20 天、21天、25天、30天、35天、40天、45天、50天的种子。盛花取下后无菌条件下迅速分离各轮花器官花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊，分别液氮速冻后-80°C保存备用。总RNA的提取同步骤(一)。以大豆组成型表达的Jcii/ (GenBank acces-sionNo. V00450)为内参基因，以来自野生大豆不同组织或器官的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR (qPCR)分析。foZ/T的扩增引物为GsLFY-qPCR sense 5‘ACAAGCCAAAGATGCGACACT 3', GsLFY-qPCR antisense :5，CGTTCTCCCCTCTCTCCTTGA 3，。结果分析表明(图1)，foZ/T在根、花以及种子中表达量较高，在茎尖和幼叶中有微弱的表达。在四轮花器官中，foz/T主要在雄蕊中表达。随着种子的发育，foZ/T的表达量逐渐上升。(三)GsLFY转录因子的功能鉴定
利用 Invitrogen 公司的 Gateway Technology with Clonase II 试剂盒，将 foZ/T 正向插入到植物表达载体 PMDC83 (Sokolov et al, 2005，PNAS, 103;9732 -9737冲，得到pMDC83-GsLFY植物过量表达载体(图2)，用冻融法将pMDC83_GsLFY转入根癌农杆菌菌株EHA105 (Avsian-Kretchmer et al, 2004， Plant Physiology, 1351685—1696)中。 pMDC83-GsLFY通过农杆菌株EHA105的介导，转化烟草，利用抗生素筛选和PCR技术筛选阳性转基因植株。利用实时荧光定量PCR技术，对foZ/T在7个阳性转基因株系(LFY1、LFY3、 LFY4、LFY5、LFY15、LFY39，LFY45)和对照组(转入pMDC83载体的转基因烟草CK_1、CK_2)的表达情况进行了分析。结果显示，与对照组相比foZ/T在转基因烟草中显著表达。统计开花期的结果分析显示，说明在烟草中过量表达野生大豆基因foZ/T能够促使烟草提早开花，开花期提前了 29. 08天，差异显著(图4)。
权利要求
1.一种野生大豆LEAFY类转录因子，命名为(isLFY，是具有序列表中的SEQ ID NO. 2所述氨基酸序列的蛋白质。
2.权利要求1所述的野生大豆LEAFY类转录因子的基因。
3.根据权利要求2所述的野生大豆LEAFY类转录因子的基因，其特征在于野生大豆 LEAFY类转录因子的cDNA基因，具有序列表中foZ/T基因SEQ ID NO. 1的DNA序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，是指pMDC83-GsLFY植物过量表达载体。
6.含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。
7.根据权利要求6所述的宿主菌，是指将foZ/T转入的根癌农杆菌菌株EHA105。
8.扩增权利要求2或3所述基因的引物，其特征是 扩增foZ/T基因组全长的引物是GsLFY sense:5，GGCGAATTCCCATGGATCCGGACGCA 3’ ； GsLFY antisense:5' GGCTCGAGTCTAGATTTAGAAGGGAAGGTG 3'； 扩增GsLFY cDNA全长的引物是 GsLFY-ORF sense5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATCCGGACGCATTCA 3'； GsLFY-ORF antisense:5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGAAGGGAAGGTGAGCACT 3'； 实时荧光定量PCR分析中涉及的foZ/T的qPCR引物为 GsLFY-qPCR sense 5’ ACAAGCCAAAGATGCGACACT 3’ ； GsLFY-qPCR antisense 5’ CGTTCTCCCCTCTCTCCTTGA 3，。
9.权利要求1所述的野生大豆LEAFY类转录因子在培育早花植物中的应用。
10.权利要求2或3所述的野生大豆LEAFY类转录因子的基因在培育早花植物中的应
全文摘要
一种野生大豆LEAFY类转录因子及其编码基因与应用，属于生物技术领域。该野生大豆LEAFY类转录因子，命名为GsLFY，是具有序列表中的SEQIDNO.2所述氨基酸序列的蛋白质。其编码基因为GsLFY基因SEQIDNO.1的DNA序列。本发明野生大豆LEAFY类转录因子及其编码基因可用于培育早花植物品种特别是早花早熟大豆品种。GsLFY为特异性表达基因，其表达模式与组织以及植株的发育阶段相关。过量表达GsLFY的转基因烟草与对照组的转基因烟草相比，其开花期提前了约29天，说明GsLFY能控制植物的成花转变，影响植物的花期，进而调控植物的生殖生长。
文档编号C12N1/21GK102153637SQ20111003909
公开日2011年8月17日 申请日期2011年2月17日 优先权日2011年2月17日
发明者喻德跃, 迟英俊, 郭文雅 申请人:南京农业大学