专利名称：Dna片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种DNA片段及其应用。
背景技术：
我国是一个人口和农业大国，但是随着人口的日益增多，仅靠简单的农业种植模式是无法保障足够的粮食产量以满足社会需求的，生物技术才是可持续农业最重要的途径。传统的农作物育种依靠杂交育种，目前智能不育分子设计育种技术也正在不断完善， 但是，不论是传统方法还是现代技术，雄性不育系的建立在植物育种中都发挥着重要作用。 花药作为重要的雄性生殖器官，它的发育分为两部分，一部分是花药的形态建成，另一部分是花粉的形成与发育，花药的正常与否将直接影响植物的雄性育性。植物花粉发育是一个非常复杂的过程，它由个体发育的不同阶段所表达的特定基因所控制(Stinson et al., 1987 ；Mascarenhas, 1989，1990)。研究表明玉米的成熟花粉中含有两万多种mRNA分子，其中的 10%具有花粉特异性(Willing andMascarenhas, 1984 ；Schrauwen et al.，1990)。已有多种花粉特异基因被分离出来，例如油菜中的三个花粉发育早期基因(Albani et al., 1990)。目前研究较为深入的是玉米中的ZM-13 (Hanson et al.，1989)和番茄中的LAT-52 基因(Twell et al.，1989b)，ZM-13在小孢子发育晚期表达，而LAT-52在四分体时期开始表达并在小孢子发生时期表达量迅速增加。水稻是世界上重要的粮食作物，水稻的杂交优势育种具有悠久的历史，雄性不育育种的出现，极大地简化了育种程序，节省劳力，解决了其他育种不容易解决的问题，利用雄性不育制种，不仅可提高制种的质量，其产量也得到了很大的提高。但传统的不育系、恢复系和保持系的选育需要大量的杂交组合试验，具有盲目性且费时费力。花粉或花药特异启动子在植物雄性不育育种中具有重要应用价值。Mariani等(1990年)将烟草花药绒毡层特异表达基因！“四的启动子与RNAase基因构建嵌合基因，导入烟草和油菜中，获得雄性不育转基因植株，从而开创了利用植物基因工程技术获得雄性不育转基因植株的新途径。 1992年，Mariani等又把烟草花药绒毡层特异表达基因D9的启动子与RNAase抑制剂基因 barstar构建嵌合基因，转化油菜获得油菜雄性不育恢复系，与含RNAase基因的转基因雄性不育系杂交后获得可育后代。我们的研究通过分子生物学的手段完成了对水稻花药中特异表达启动子的调控元件的鉴定工作，并证明了它们的时空表达模式，明确了其在花粉发育特异时期的表达，从而在农业生产上为遗传育种的相关基础与应用研究提供一定的理论和实践指导作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA片段。本发明提供的 DNA 片段是从水稻(0. sativa ssp. Japonica variety iZhonghua 11’)基因组分离得到的核苷酸片段并且具有启动子活性。本发明中的术语“启动子”系指 DNA上一段序列，RNA聚合酶结合到该序列上，可以起始基因的转录。
所述DNA片段的核苷酸序列是如下1)或2)或3):1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液， pH7. 2,7% SDS)中，65°C预杂交30min ；弃预杂交液，加入杂交液(0. 25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2,7% SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65°C杂交12hr ；弃杂交液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,5% SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ；加入洗膜液 II (20mmol/L 磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,1% SDS)，65°C洗膜 30min。本发明的DNA片段还包括与来自SEQ ID NO. 1的片段的核苷酸序列互补的核苷酸序列。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对原则产生的之意。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有优选地75%或更高，更优选地85%或更高，甚至更优选地90% 或更高，以及最优选地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％ )表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。含有上述DNA片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。上述重组载体是将上述的DNA片段代替pCAMBIA1301载体中⑶S基因的3 启动子后得到的重组载体。含有上述DNA片段的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。含有上述DNA片段的重组菌也属于本发明的保护范围之内。上述重组菌可以是含有上述DNA片段的农杆菌。本发明的另一目的在于提供上述的DNA片段作为启动子的应用。上述启动子可为花粉组织特异性表达启动子。优选可为水稻花粉组织特异性表达启动子。本发明的又一目的在于提供上述的DNA片段在构建水稻智能两系育种中的应用。实验证明本发明的DNA片段作为启动子能够特异地驱动下游GUS基因从单核晚期花粉中开始表达，直至花粉完全成熟。利用本发明的DNA片段作为启动子可以构建不育系和恢复系基因，从而构建水稻智能两系育种。其次，本发明的DNA片段作为花粉特异表达启动子可为水稻及其它农作物花粉生长发育基因的功能分析及表达调控研究提供了一个有力的工具，可以配合使用该组启动子连接花粉发育功能基因，分析其表达量、表达时期与表型的关系，从而探明花粉特异基因的功能。此外，本发明的DNA片段作为启动子还为水稻等转基因食品的安全性研究和开发创造了有利条件，在预防转基因植物通过授粉途径发生基因漂移和延长花卉的货架寿命等方面都具有重大的应用前景。
图1为PCR扩增的凝胶电泳结果。图2为⑶S载体的构建过程。图3为水稻花粉的发育过程，A、造胞细胞，B、花粉母细胞，C、四分体，D、单核早期， E、单核晚期，F、双核早期，G、双核中期，H、双核晚期，I、未成熟三核时期，J、DAPI染色未成熟三核时期花粉，K、成熟三核时期，L、DAPI染色成熟三核时期花粉。图4为水稻花粉特异性表达启动子驱动GUS表达检测结果，A、花粉母细胞时期小花，B、四分体时期小花，C、单核早期小花，D、单核晚期小花，E、双核早期小花，F、双核中期小花，G、双核晚期小花，H、成熟三核时期小花，I、单核晚期花粉粒，J、双核时期花粉，K、成熟三核时期花粉粒。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、水稻花粉特异性表达启动子的获得及其检测分析我们采用RACE方法从水稻cDNA库克隆到了一个花药基因，为了检测它的表达模式，我们分别用RT-PCR和原位杂交的方法进行分析。RT-PCR检测分别以水稻根、茎、内外稃及雌蕊、种子、穗子、花药和花粉为材料提取RNA，并反转录为cDNA，用特异引物进行 RT-PCR分析，结果显示这个基因特异的在雄蕊尤其是花粉中表达。原位杂交分析将不同发育时期的水稻花药取材后经过脱水透明等处理后，最终将其包埋到石蜡中。然后将蜡块中的材料切成8μπι厚的蜡片，再经脱蜡、复水、除蛋白等前处理后，用基因特异区段的RNA 探针进行杂交，最后经显色检测基因的组织表达特性。结果如显示，这个基因在花药绒毡层和花粉粒中均表达。上述两种方法均证明该基因在水稻花粉粒中特异表达，我们利用突变体和RNAi 的方法对这个基因的功能研究也证明它的确对水稻花药的发育和花粉粒的育性起着至关重要的作用(待发表)。由于基因的时空表达模式是受基因上游的启动子区域所调控的，因此，在研究基因功能的同时也有必要对它们的启动子序列及表达特征进行分析。一、水稻花粉特异性表达启动子序列的获得根据水稻中目的基因的cDNA序列，选取转录起始位点上游2000bp左右的DNA序列为能够行使调控功能的完整启动子区域(基本启动子和5’ UTR区域)， 在NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov)数据库中查找各启动子的电子序列。然后根据各启动子序列设计特异引物(PF =GAC CCCGGG GGAACTCACCGGCTAGCCATC和PR =CAG TCTAGAGGCGGAGGCAGAATCCCCTCT，引物中所加的酶切位点为上游引物Sam I (GAC CCCGGG)， 下游引物 Xba I (CAG TCTAGA))，以水稻(0. sativa ssp. Japonica variety iZhonghuall', 购自中国农科院作物科学研究所)基因组DNA为模板，，用ExTaq酶进行PCR扩增，由PCR扩增的凝胶电泳结果(如图1所示)可知得到1991bp的目的片段。扩增产物经切胶纯化后连接到T-easy载体上，转入大肠杆菌DH5ci，筛选阳性克隆，进行PCR、酶切、测序鉴定。测序结果表明其具有序列表中序列1的自5’端的第1-1991的碱基，命名为I^romoter。二、水稻花粉特异性表达启动子的检测分析1、启动子驱动⑶S的时空表达特征(1)克隆载体的构建对pCAMBIA1301 (购自Cambia公司)进行改造，以Hind III和Nco I进行双酶切 PCAMBIA1301载体，回收大片段，以Klenow酶补平粘性末端，得到两平末端，用T4连接酶将两平末端连接，即将母载体PCAMBIA1301 (Cornejo et al.，1993)改建为pGUS1301。然后分别用)(ba I和Sma I双酶切ρ⑶S1301载体，再用T4连接酶连接经相同酶切(即用)(ba I和Sma I双酶切)后的上述步骤一中扩增得到的启动子(Promoter)，得到构建成的载体， 命名为P::GUS载体。载体构建过程如图2所示。(2)水稻的遗传转化利用农杆菌介导的双元载体系统对水稻进行遗传转化，将上述步骤(1)中构建好的P:⑶S载体导入EHA105农杆菌工程菌株，然后按照已有的成熟方法进行转化(Hieiet al. ,1994 ；Huang et al. ,2000)开展水稻的遗传转化工作，对转化后的植株进行鉴定，得到转基因阳性植株。(3)⑶S染色鉴定对上述步骤O)中转化成功的各转基因株系(转基因阳性植株)进行分子鉴定， 然后将阳性转基因苗进行GUS染色分析，染色后的花、花药和花粉在解剖镜和体式显微镜下照相。为了详细研究基因的表达模式，对水稻花粉发育时期进行了详细的划分(如图3 所示)，图中可见花粉发育各个时期的形态，A为造胞细胞，B为花粉母细胞，C为四分体，D 为单核早期，E为单核晚期，F为双核早期，G为双核中期，H为双核晚期，I为未成熟三核时期，J为DAPI染色未成熟三核时期花粉，K为成熟三核时期，L为DAPI染色成熟三核时期花粉。进行GUS染色，检测结果(如图4所示)显示，从图4中D(单核晚期小花)开始显色，到图4中E (双核早期小花)、F(双核中期小花)、G(双核晚期小花)和H(成熟三核时期小花)均为蓝色。由图4中I (单核晚期花粉粒)、J(双核时期花粉)和K(三核时期花粉粒)中的花粉粒均显示为明显的蓝色，更进一步确认了 GUS染色结果。通过上述GUS 染色检测结果可知本实施例得到的启动子能够特异地驱动下游GUS基因从单核晚期花粉中开始表达，直至花粉完全成熟。
权利要求
1.一种DNA片段，其核苷酸序列是如下1)或2)或3):1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述的DNA片段的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是将权利要求1所述的DNA片段代替pCAMBIA1301载体中⑶S基因的3 启动子后得到的重组载体。
4.含有权利要求1所述的DNA片段的转基因细胞系。
5.含有权利要求1所述的DNA片段的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是含有权利要求1所述DNA 片段的农杆菌。
7.权利要求1所述的DNA片段作为启动子的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述启动子为花粉组织特异性表达启动
全文摘要
本发明公开了DNA片段及其应用。本发明的DNA片段，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。实验证明本发明的DNA片段作为启动子能够特异地驱动下游GUS基因从单核晚期花粉中开始表达，直至花粉完全成熟。
文档编号C12N5/10GK102199601SQ20111003897
公开日2011年9月28日 申请日期2011年2月16日 优先权日2011年2月16日
发明者刘源, 吴凤, 孟征, 杜晓秋, 闫硕 申请人:中国科学院植物研究所