专利名称：检测两段未知的dna片段中共有/相同的dna序列的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法，适用 于发现和扩增两段未知的DNA片段中共有的、一致的DNA序列。属于基因技术领域。
背景技术：
目前，对于两段DNA片段中的共有、一致序列的发现，常用的方法是对两个片段分 别测序，然后比对两段碱基序列，发现其共有的一致序列。该方法缺点是1、必须对两段DNA片段进行全部测序后才能比对。目前的测序技术一个反应可以 测约800个碱基，对于大于800个碱基的序列，必须根据已测的序列设计引物，然后进行多 次反应，拼接结果得到全部序列。这种方法对于有特殊结构的DNA片段，以及比较大的DNA 片段(例如> IOkb)不能很好的得到结果，无法比对。2、很多时候研究者仅希望知道两段DNA片段之间的共有、一致的序列，并不希望 知道它们的全序列。3、对于大片段DNA或者是整个染色体组的比较，不仅费时、费力，而且相当的不经 济。其他的方法如杂交技术，可以知道两个DNA片段间是否有共有序列，但序列的具体内容 就无法知道。目前广泛运用的DNA芯片技术也可以用于研究，但该方法同测序一样，运用范 围非常受限、而且价格昂贵。
发明内容
本发明的目的，是为了了解两段未知的DNA序列中共有的、一致的核苷酸序列，提 供一种检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法。本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法，其特征在于首先对二 个目标DNA片段进行酶切后分别加入能同酶切片段的5’端结合的接头之一和接头之二，然 后将加入不同接头的酶切片段进行杂交、退火，再加入酶补齐双链DNA片段缺口，最后加入 针对前述二个接头设计的引物进行PCR扩增，将所述二个目标DNA片段中一致的序列扩增 出来。通过以上的处理，只有二个目标序列中一致的序列才能被扩增出来。再对扩增后 的产物再进行测序，可以知道具体的核苷酸序列。本发明的目的还可以通过采取如下技术方案达到本发明的进一步的实施方案，其特征是1)利用酶切频率较高的限制性内切酶如Rsal等对需要比较的DNA片段A和片段 B进行酶切，获得大小在300-600bp的酶切片段；2)分别对二个酶切产物加入接头之一和接头之二，用T4连接酶进行连接，所述接 头为特殊设计，5’端的核苷酸去掉了磷酸基团，保证了接头仅能与酶切片段的5’进行连 接；
3)将两个连接了不同接头的酶切片段混合，首先在92°C 96°C条件下变性3 7 分钟，然后在55°C 96 °C条件下退火；4)将退火后的产物用聚合酶补平两端的缺口，加入针对二个不同的接头设计的弓I 物进行PCR扩增；仅有片段A和片段B中一致的、共有序列能够得到指数扩增；5)通过指数扩增，检测出不同DNA片段中一致、共有的序列。本发明的进一步的实施方案，其特征是所述接头之一核苷酸序列如序列表SEQ ID No 1所示，所述接头之二核苷酸序列如序列表SEQ ID No 2所示，所述接PCR扩增引物 序列如序列表SEQ ID Na 3所示。本发明具有如下有益效果1、本发明利用了 PCR反应链内退火优于链间退火的特点和分子杂交二级动力学 原理，在生物、医学、遗传等广阔的领域具有较高的实用价值。而且该方法操作简便，对实验 条件要求不高，普通的实验室均可进行。2、采用本发明可以对不同来源，不同大小的DNA片段的共有序列进行研究，不需 要预先获知全部的核苷酸序列。
图1是本发明具体实施例1的检测过程示意图。
具体实施例方式具体实施例1 下面结合图例具体说明本发明的原理及步骤参照图1，本实施例的具体方法步骤如下1)利用酶切频率较高的限制性内切酶如Rsa 1等对需要比较的DNA片段A和片段 B进行酶切，获得大小在300-600bp的二个酶切片段，参照图1中的①处所示；2)分别对前述二个酶切片段加入接头之一、接头之二，用T4连接酶进行连接，所 述接头为特殊设计，即5’端的核苷酸去掉了磷酸基团，保证了接头仅能与酶切片段的5’进 行连接；参照图1中的②处所示；3)将所述两个连接了不同接头的酶切片段混合，首先在94°C条件下变性5分钟， 然后在55°C条件下退火；如果片段A和片段B中存在共同的或一致的序列，经过处理后，就 会出现图1中③处所示的a、b、c三种结合；如果没有共同的或一致的序列，即仅会出现图1 中③处所示的a和b 二种结合；4)将退火后的片段A和片段B用聚合酶补平两端的缺口，加入针对二个不同的接 头设计的引物进行PCR扩增；若片段A和片段B中存在一致的、共有序列，即能够得到指数 扩增，如图1中④处的c所示；若片段A和片段B中不存在一致的、共有序列，由于“补平” 后两段序列两端呈现“回文结构”，在PCR退火的过程的中形成“锅柄”样结构，即不能得到 指数扩增；5)通过指数扩增，检测出不同DNA片段中一致、共有的序列。通过以上的步骤，达到了指数扩增不同DNA片段中一致、共有的序列的目的。再将 PCR产物进行测序，就可以明确这段序列的核苷酸序列。
本实施例中，所述的酶切、退火、“补平”方法，可以采用常规的酶切、退火、“补平” 技术，PCR扩增。所使用的接头序列可以采用特殊的设计，例如使用的接头之一的核苷酸序列5’ -TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，3’ -GGCCCGTCCA-5’使用的接头之二的核苷酸序列5， -AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，3’ -GCCGGCTCCA-5’其中，接头之一和接头之二的5’端的核苷酸均去掉磷酸基团，保证了接头仅能与 酶切片段的5’进行连接。所述接头序列也可以根据实际的需求做出调整，例如加入酶切位点等。本实施例中使用的PCR扩增弓I物序列为Pl :5’ -TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，P2 :5’ -AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，除了可以使用上述的接头之一、接头之二的核苷酸序列和PCR扩增引物序列外， 本发明还可以另行设计其他接头核苷酸序列和PCR扩增引物序列。本发明的应用实例1:用于研究质粒的相同序列。临床来源的2个菌株中各携带一个质粒，研究者希望得知到这两个质粒中是否存 在有相同序列。运用本方案中的方法和步骤，如果2个质粒存在有相同的序列，则该序列将 被指数级的扩增出来，如果没有相同的序列，则没有明显的扩增产物。对扩增出的产物测序 可明确该相同序列的核苷酸排列情况。本发明的应用实例2:构建cDNA文库中的运用。研究者在比较2个的菌株中的表达情况时，除了关心表达的不同外，同时也关心 哪些基因的表达是相同的。提取全菌的RNA并逆转录成cDNA后，运用本方案中的方法和步 骤，相同表达的基因将被指数级的扩增出来，再通过其测序获得核苷酸序列，用这些序列构 建出2个菌的相同表达的cDNA文库。本发明的应用实例3:整合子中基因盒的研究。整合子中通常包含有多个“基因盒”，而“基因盒”的数量和种类存在差异。当研究 者希望知道2个整合子中的相同的“基因盒”的种类和数量，就可以运用运用本方案中的方 法和步骤，将2个整合子中相同的“基因盒”的序列指数级的扩增出来，再测序即可知道是 那种“基因盒”以及有几种相同的”基因盒”。其他具体实施例本发明其他具体实施例的特点是将具体实施例1的第3步修改为3)将两个连接了不同接头的酶切片段混合，首 先在92 °C条件下变性7分钟，然后在53 °C条件下退火；或者首先在96 °C条件下变性3分钟，然后在57°C条件下退火；如果片段A和片段B中有一致的序列，进过处理后，会出现图1中 ③所示的a、b、c等3种结合；如果没有一致的序列，仅会出现a和b的2种结合；其余同具 体实施例1。
权利要求
检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法，其特征在于首先对二个目标DNA片段进行酶切后分别加入能同酶切片段的5’端结合的接头之一和接头之二，然后将加入不同接头的酶切片段进行杂交、退火，再加入酶补齐双链DNA片段缺口，最后加入针对前述二个接头设计的引物进行PCR扩增，将所述二个目标DNA片段中一致的序列扩增出来。
2.根据权利要求1所述的检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法， 其特征在于1)利用酶切频率较高的限制性内切酶如Rsa1等对需要比较的DNA片段A和片段B进 行酶切，获得大小在300-600bp的酶切片段；2)分别对二个酶切产物加入接头之一和接头之二，用T4连接酶进行连接，所述接头为 特殊设计，5’端的核苷酸去掉了磷酸基团，保证了接头仅能与酶切片段的5’进行连接；3)将两个连接了不同接头的酶切片段混合，首先在92°C 96°C条件下变性3 7分 钟，然后在55°C 96 °C条件下退火；4)将退火后的产物用聚合酶补平两端的缺口，加入针对二个不同的接头设计的引物进 行PCR扩增；仅有片段A和片段B中一致的、共有序列能够得到指数扩增；5)通过指数扩增，检测出不同DNA片段中一致、共有的序列。
3.根据权利要求1或2所述的检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的 方法，其特征在于所述接头之一的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo 1所示，所述接头之二 的核苷酸序列如序列表SEQ IDNa :2所示，所述接PCR扩增引物序列如序列表SEQ IDNs 3 所示。全文摘要
本发明涉及检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法，其特征在于首先对二个目标DNA片段进行酶切后分别加入能同酶切片段的5’端结合的接头之一和接头之二，然后将加入不同接头的酶切片段进行杂交、退火，再加入酶补齐双链DNA片段缺口，最后加入针对前述二个接头设计的引物进行PCR扩增，将所述二个目标DNA片段中一致的序列扩增出来。通过以上的处理，只有二个目标序列中一致的序列才能被扩增出来。再对扩增后的产物再进行测序，可以知道具体的核苷酸序列。本发明利用了PCR反应链内退火优于链间退火的特点和分子杂交二级动力学原理，在生物、医学、遗传等广阔的领域具有较高的实用价值。具有操作简便、普通的实验室均可进行的特点。
文档编号C12Q1/68GK101942509SQ201010198829
公开日2011年1月12日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者卓超, 黎晓强 申请人:广州医学院第一附属医院;广州呼吸疾病研究所