专利名称：大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30 K的RNAi植物表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一个大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体的构 建，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference,简称RNAi)，又称为转录后基因沉默，是一种快速关 闭基因的新方法。也是研究生物体基因表达、调控与功能的一项新技术，其实质是小干扰 RNA(small interfering RNA, siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默。其作用 机理是siRNA与对应的mRNA特异结合并引起降解，从而阻止mRNA的翻译，特异性抑制靶基 因的表达，因此成为基因敲除(gene knockout)的强大工具。目前，随着研究的不断深入， RNAi的机制正被逐步阐明，同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为 人们所重视。大豆[Glycine max(L. )Merr.]食物过敏是一个全世界密切关注的公共健康问题。 大豆蛋白在食品加工业的广泛应用，给大豆过敏人群带来了一定的食物安全问题。调查发 现，全世界约2 %的成年人和6 % 8 %的儿童患有食物过敏症，大豆过敏症多发于5岁以下 的幼儿，主要表现为胃部不适或过敏性皮炎，主要的症状是口周红斑、唇肿、起疹子、皮肤发 痒、腹泻等，严重时可危及生命。如何降低大豆过敏原含量，保证大豆食品安全，已经成为一 个世界范围内的重大课题。最安全有效防止大豆食品过敏的措施就是培育脱致敏的大豆新品种。尽管传统育 种技术已经成功地改善了大豆的营养价值，然而，这种过程不仅耗时，而且利用空间有限， 也很难同时改变大豆多个品质性状，毕竟，大豆可改良的遗传资源是有限的，并且对于大豆 性状的改良只限于已经得到的突变体材料。而RNA干扰技术，能够扩大可操作基因的范围 和突变的种类，且对目的基因的表达有了可控性，同时RNAi所具有的特异性、稳定性、高 效、快速以及不改变其它基因的表达等特性，为RNAi在植物功能基因组学研究以及植物的 遗传改良等方面提供了一个强有力的手段。RNAi技术在作物品质改良上具有广阔的应用前
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发明内容
技术问题本发明涉及大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体 的构建，属于分子生物学领域。构建的RNAi植物表达载体可导入大豆及其它含有过敏蛋白 质的植物，消除过敏蛋白质对过敏人群的危害，可用于植物品种改良。技术方案DGly m Bd 30K干扰片段的克隆选用‘南农32’作为材料，取幼嫩籽粒，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒 说明书提取豆粒总RNA，取2 μ g总RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA产物。设计引物扩增 Gly m Bd 30K干扰片段
Ps CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCC,Pa GATGGTCACAAGAATATTGTTC,Gly m Bd 30K干扰片段长395bp，进行常规聚合酶链式(PCR)反应，以提取的cDNA 为模板，扩增程序为94°C预变性5min，94°C变性30sec，51. 8°C复性30sec，72°C延伸lmin， 30个循环后，72°C总延伸lOmin，将PCR产物连接到pMD19_T载体上，转化TOPlO细胞，进行 序列测定后续实验中备用。2)内含子片段的克隆设计引物扩增内含子片段Is GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT,IaCTGTAACTATCATCATCATCAT,内含子片段长190bp，进行常规PCR反应，pCAMBIA1301质粒为模板，扩增程序为 94°C预变性 5min，94°C变性 30sec，45. 3°C复性 30sec，72°C延伸 lmin, 30 个循环后，72°C总 延伸lOmin，将PCR产物连接到pMD19_T载体上，转化TOPlO细胞，进行序列测定后续实验中3) Gly m Bd 30K干扰载体的构建通过融合PCR的方法将三个片段[30k_antisense(A)、intron(I)和 30k-sense(S)]连接起来。设计四条引物，PI、P2、P3、P4，在两端引入酶切位点BstE II和 PmI I。引物序列Pl:acCACGTGGATGGTCACAAGAATATTGTTCCTTC P2 :ACTAGAAATTTACCCTTGTGTTG (P2 各有 A 和 I 的一部分)P3 GAAGCAACACAAGGCTGTAACTATCA (P3 各有 I 和 S 的一部分)P4 tatGGTGACCGATGGTCACAAGAATATTGTTC载体PMD-A-I-S 和 pCAMBIA1301 双酶切 Bst ΕΙΙ/PmI I，将 A-I-S 结构连入 PCAMBIA1301 形成干扰载体 pCAScil-1301。Bst ΕΙΙ/PmI I 双酶切反应5yL Buffer 1， 0. 5μ L BSA，15yL质粒，IyL PmI I补水至50 μ L，37°C反应2h ；酶切结束后，再加入1 μ L Bst E II，60°C反反应lh。转入T0P10后进行PCR和酶切验证，构建成功。有益效果1.本发明构建的Gly m Bd 30K RNAi载体pCAscil_1301为大豆中首次报道，可导 入大豆及其它过敏作物中，消除过敏蛋白质对过敏人群的危害，可进行植物品种改良。2.国内外研究表明利用RNAi技术，能快速有效地关闭相应基因，使得生物体产生 相应的功能缺表型，从而可确定对应基因的功能，且具有特异性、高效性和广泛性的优势。3. RNAi比反义RNA技术更有效，能在低于反义核酸几个数量级的浓度下，使目标基 因表达降到极低水平甚至完全“剔除”，从而产生缺失突变体表型，因此更容易产生功能丧失。4.与T-DNA技术造成的功能永久性缺失相比，RNAi技术通过与细胞特异性启动子 及可诱导系统结合使用，其抑制基因表达的时间可以随意控制。
四
图1干扰载体的双酶切鉴定
1 :pCAscil-1301 质粒2 :pCAMBIA1301/BstE II /Pml I3 :pCAscil-1301/BstE II /Pml I4 :DNA Marker图2 Gly m Bd 30K发卡结构示意3 Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体质粒图谱
五具体实施例方式构建策略1>内含子的选择一选用常用表达载体PCAMBIA1301中⑶S基因的内含子序列，来 做干扰载体的中间片段；2>Gly m Bd 30K干扰片段的选择一利用BLAST数据库比对，取位于Gly m Bd 30K 编码区内，与大豆基因组其它基因同源性较低的片段；3>发卡结构插入位点的选择一将发卡结构引入PCAMBIA1301载体⑶S基因的 His-tag终止子TGA后。4>发卡结构的模式为反义片段+内含子+正义片段Gly m Bd 30K RNAi 载体 pCAscil-1301 的构建过程1. Gly m Bd 30K干扰片段的克隆选用‘南农32’(审定品种，审定编号国审豆2008025，市场购买)作为材料，取幼 嫩籽粒，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒说明书提取豆粒总RNA，取2 μ g总RNA 合成cDNA，用RNase消化cDNA产物。设计引物扩增Gly m Bd 30K干扰片段Ps CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCC,Pa GATGGTCACAAGAATATTGTTC,Gly m Bd 30K干扰片段长395bp，进行常规聚合酶链式(PCR)反应，以提取的cDNA 为模板，扩增程序为94°C预变性5min，94°C变性30sec，51. 8°C复性30sec，72°C延伸lmin， 30个循环后，72°C总延伸lOmin，将PCR产物连接到pMD19_T载体上，转化T0P10细胞，进行 序列测定后续实验中备用。Gly m Bd 30K干扰片段序列CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCCCTCTTAGGTCTCTCTTCTAGTTCCAGCATATCAACTCATCGTTCCATATTGGACCTTGACCTAACCAAGTTTACCACACAGAAACAGGTGTCTTCACTGTTCCAACTATGGAAGAGTGAGCATGGACGTGTCTACCATAACCACGAAGAAGAGGCAAAGAGACTTGAGATTTTCAAGAATAACTTGAACTATATCAGGGACATGAATGCAAACAGAAAATCACCCCATTCTCATCGTTTAGGATTGAACAAGTTTGCTGACATCACTCCTCAAGAGTTCAGCAAAAAGTACTTGCAAGCTCCCAAGGATGTGTCGCAGCAAATCAAAATGGCCAACAAGAAAATGAAGAAGGAACAATATTCTTGTGACCATC2.内含子片段的克隆设计引物扩增内含子片段Is GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT,Ia CTGTAACTATCATCATCATCAT,
内含子片段长190bp，进行常规PCR反应，pCAMBIA1301质粒为模板，扩增程序为 94°C预变性 5min，94°C变性 30sec，45. 3°C复性 30sec，72°C延伸 lmin，30 个循环后，72°C总 延伸lOmin，将PCR产物连接到pMD19_T载体上，转化TOPlO细胞，进行序列测定后续实验中内含子序列TAAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG3.正义、反义基因及内含子三个片段的融合通过融合PCR的方法将三个片段[30k_antisense(A)、intron(I)和 30k-sense(S)]连接起来。设计四条引物，PI、P2、P3、P4，在两端引入酶切位点BstE II和 PmI I。引物序列Pl:acCACGTGGATGGTCACAAGAATATTGTTCCTTCP2 :ACTAGAAATTTACCCTTGTGTTG (P2 各有 A 和 I 的一部分)
P3 GAAGCAACACAAGGCTGTAACTATCA (P3 各有 I 和 S 的一部分)P4 tatGGTGACCGATGGTCACAAGAATATTGTTC(1)第一轮PCR:以Gly m Bd 30K干扰片段为模板，PI、P2为引物进行扩增PCR反应体系5 μ L 5x Pfu Buffer, 2. 5 μ L dNTPs, 1 μ L Gly m Bd 30Κ干扰片段 作模板，引物Pl、P2各1 μ L，0. 25 μ L Pfu酶，最后灭菌水至25 μ L ；PCR反应程序二温法， 94°C预变性3min，94°C复性30sec，68°C延伸45sec，共30个循环，最后68°C延伸IOmin。获 得部分融合的A。力口 A 反应5 μ L IOx A—Tailing Buffer,4y L dNTP Mixture,0. 5 μ L Α-Tailing Enzyme，4 μ gDNA最后补水至50 μ L。72°C反应20min，冰置1 2min。最后连入T载体测序。(2)第二轮PCR 以A和I为模板，PI、P3为引物进行扩增PCR 反应体系:5μ L 5x Pfu Buffer, 2. 5 μ L dNTPs, A 片段和 I 片段各 1 μ L 作模 板，引物Ρ1、Ρ3各lyL，0. 25yL Pfu酶，最后灭菌水至25 μ L ;PCR反应程序二温法，94°C 预变性3min，94°C复性30sec，68°C延伸45sec，共30个循环，最后68°C延伸IOmin。获得部 分融合的A-I。力口 A 反应5 μ L IOx A—Tailing Buffer,4y L dNTP Mixture,0. 5 μ L Α-Tailing Enzyme，4 μ gDNA最后补水至50 μ L。72°C反应20min，冰置1 2min。最后连入T载体测 序，得 PMD-A-I。(3)第三轮PCR:以融合片段A-I和Gly m Bd 30K干扰片段为模板，A-I的PCR反 应液、P4为引物进行megaprimer PCR扩增PCR 反应体系2· 5μ L IOx E Buffer,2y L dNTPs,2y L MgCl2，融合片段 A-I 和 Glym Bd 30Κ 干扰片段各 1 μ L 作模板，引物 200ng megaprimer,P4 1 μ L，0. 25 μ L Pfu 酶， 最后灭菌水至25 μ L ；PCR反应程序二温法，94 °C预变性3min，94°C复性30seC，68°C延伸45sec，共30个循环，最后68°C延伸lOmin。获得发卡结构A_I_S。直接连入T载体，得
PMD-A-I-S亚克隆测序。 4. RNAi植物载体的完成载体PMD-A-I-S 和 pCAMBIA1301 双酶切 Bst ΕΙΙ/PmI I，将 A-I-S 结构连入 PCAMBIA1301 形成干扰载体 pCAScil-1301。Bst ΕΙΙ/PmI I 双酶切反应5 μ L Buffer 1,0. 5μ L BSA，15 μ L 质粒，1 μ L PmI I 补水至50yL，37°C反应2h ；酶切结束后，再加入IyL Bst E II，60°C反反应lh。转入TOPlO 后进行PCR和酶切验证，构建成功。综上所述，本发明构建的Gly m Bd 30K RNAi载体pCAscil-1301为大豆中首次报 道，可进行植物品质改良。国内外研究表明利用RNAi技术，能快速有效地关闭相应基因。
权利要求
大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体的构建。1)Gly m Bd 30K干扰片段的克隆选用‘南农32’作为材料，取幼嫩籽粒，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒说明书提取豆粒总RNA，取2μg总RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA产物，设计引物PsCCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCC，PaGATGGTCACAAGAATATTGTTC，扩增Gly m Bd 30K干扰片段，Gly m Bd 30K干扰片段长395bp，进行常规聚合酶链式PCR反应，以提取的cDNA为模板，扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30sec，51.8℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，将PCR产物连接到pMD19 T载体上，转化TOP10细胞，进行序列测定后续实验中备用；2)内含子片段的克隆设计引物IsGTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT，IaCTGTAACTATCATCATCATCAT，扩增内含子片段，内含子片段长190bp，进行常规PCR反应，pCAMBIA1301质粒为模板，扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30sec，45.3℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，将PCR产物连接到pMD19 T载体上，转化TOP10细胞，进行序列测定后续实验中备用；3)Gly m Bd 30K干扰载体的构建通过融合PCR的方法将三个片段正义基因A、内含子I及反义基因S三个片段的融合连接起来，设计四条引物P1acCACGTGGATGGTCACAAGAATATTGTTCCTTCP2ACTAGAAATTTACCCTTGTGTTGP3GAAGCAACACAAGGCTGTAACTATCAP4tatGGTGACCGATGGTCACAAGAATATTGTTC两端引入酶切位点BstE II和PmI I，载体PMD A I S和pCAMBIA1301双酶切Bst EII/PmI I，将A I S结构连入pCAMBIA1301形成干扰载体pCAScil 1301，Bst EII/PmI I双酶切反应5μL Buffer 1，0.5μL BSA，15μL质粒，1μL PmI I补水至50μL，37℃反应2h；酶切结束后，再加入1μL Bst E II，60℃反反应1h；转入TOP10后进行PCR和酶切验证，构建成功大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体。
2.权利要求1所述过敏蛋白质基因Glym Bd 30K的RNAi植物表达载体的应用。
全文摘要
本发明涉及大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30 K的RNAi植物表达载体的构建，属于分子生物学领域。分别设计引物扩增Gly m Bd 30 K干扰片段和内含子片段连接pMD19-T载体，转化TOP10。在两端引入酶切位点，将三个片段[30k-antisense(A)、intron(I)和30k-sense(S)]连接起来，将A-I-S结构连入pCAMBIA1301形成干扰载体pCAScil-1301。该RNAi植物表达载体转化大豆将会对过敏蛋白质基因进行基因沉默，为确保过敏人群安全食用大豆奠定坚实基础。对提高我国大豆分子育种的技术水平具有重要理论和实践意义。
文档编号C12N15/113GK101921804SQ20101019844
公开日2010年12月22日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者刘思辰, 朱月林, 杨立飞, 盖钧镒 申请人:南京农业大学