专利名称：用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物。
背景技术：
弓形虫(Toxoplasma gondii.)是一种人类和动物体内的专性细胞内寄生原虫。 呈世界性分布，宿主范围十分广泛，细胞内专性寄生，能侵染包括人类在内的所有温血脊椎 动物。猫是弓形虫的终末宿主，猫感染弓形虫后主要通过粪便感染其他宿主。在哺乳动物 中，小鼠和猪对弓形虫尤为敏感，常能表现出明显的临床症状，在感染后产生大量的速殖子 在血液中穿行。而其他动物被弓形虫感染后通常没有明显的临床表现，弓形虫在体内形成 包囊寄生在宿主体内。弓形虫属机会致病原虫(opportunistic protozoan)，在人群中的感 染比例相当高，全世界约有1/3的人检测抗体成阳性，人感染弓形虫后通常不发病，但是在 在免疫抑制及免疫缺陷人群，如器官移植、恶性肿瘤及艾滋病患者中，弓形虫会引发严重的 临床并发症，是重要的致死病因之一；孕妇在怀孕期间感染弓形虫会传染给胎儿，引发先天 性弓形虫病，可导致死胎、胎儿或婴幼儿发育畸形、智力障碍、脑炎、脑膜炎等，严重者会导 致死亡。弓形虫的现有检测方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断方法、血清学诊 断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法包括组织学诊断、动物接种试验和细胞培养 法，需要一定数量的实验动物，而且实验周期较长。血清学诊断方法包括美蓝染色试验、间 接荧光抗体试验(IFAT)、凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。分子生物学诊断方法 主要包括聚合酶链式反应(PCR)和荧光核酸探针分子杂交。分子生物学诊断方法比前两种 方法快速、灵敏，但需要使用专门的仪器，如PCR仪，而荧光探针的制备比较昂贵，不适于基 层应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测弓形虫的环介导等温扩增(Loop-mediaed isothermal amplificaion, LAMP)反应弓I物。为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引 物，其是根据弓形虫RH株的保守基因，AF146527基因设计的两套引物，AF146527基因序 列如Seq ID No. 1所示。两套引物包括与弓形虫AF146527重复区基因结合的内侧引物 对和与弓形虫AF146527重复区基因结合的外侧引物对，其中所述内侧引物对包括内侧上 游引物 FIP1 5 ‘ -CCGGTGTCTCTTTTTCCACCCTTCGGAGAGGGAGAAGATGTT-3 ‘，内侧下游引物 BIPl 5 ‘ -CCTCGTGGTGATGGCGGAGATCCCTTCGTCCAAGCCTC-3 ‘；以及内侧上游引物 FIP2 5 ‘-CGGTGTCTCTTTTTCCACCCTTTTTTCGGAGAGGGAGAAGATGTTT-3'，内侧下游引物 BIP2 :5 ‘ -C TCGTGGTGATGGCGGAGATTTTCGTCCAAGCCTCCGACTCTG-3 ‘；所述外侧弓丨物对包括外侧上游弓丨物 F3 5' -GTTGGGAAGCGACGAGAG-3 ‘，外侧下游引物B3 :5 ‘ -ACAGTGCATCTGGATTCCTC-3 ‘； 以及外侧上游引物F3 ‘ 5 ‘ -GTTGGGAAGCGACGAGAG-3 ‘，外侧下游引物B3 ‘5' -CAGTGCATCTGGATTCCT-3‘。其中，第一套引物组包括 FIP1、BIP1、F3、B3，第二套引物 组包括 FIP2、BIP2、F3'、B3'。本发明还提供上述引物在检测弓形虫中的应用，具体方法为1)提取弓形虫DNA ； 2)利用上述的内侧引物对和外侧引物对进行环介导等温扩增反应；3)结果检测。所述环介导等温扩增反应体系如下
反应成分
加入量 所述结果检测的方法包括琼脂糖凝胶电泳法、显色法等。本发明进一步提供含上述用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物的试剂盒， 其包括两套引物组、Bst DNA聚合酶、反应混合液(包括10x Thermopol缓冲液、甜菜碱)、 弓形虫DNA阳性对照、双蒸水(ddH20)。本发明的优点在于(1)采用本发明提供的引物进行弓形虫检测，特异性和灵敏度高，可检测出100fg 的弓形虫DNA。(2)与PCR检测方法相比，应用本发明提供的用于检测弓形虫的环介导等温扩增 反应引物，不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属或水浴锅即可。(3)检测结果使用荧光染料即可判定，操作简单方便。(4)本发明的引物可应用于基层现场进行的临床医学检测，特别适于基层临床医 学检测工作及现场即时检测。
图1为本发明弓形虫LAMP检测方法琼脂糖凝胶电泳判定结果，其中1为阴性对照，2-8为含有弓形虫DNA的样本；
图2为本发明弓形虫LAMP检测方法显色可视化判定结果，其中N为阴性对照，P为 含有弓形虫DNA的样本；图3为本发明弓形虫LAMP检测方法的特异性检测结果，其中M代表DNA Marker, 1-5表示反应体系中的模板DNA分别为弓形虫、艾美耳球虫、伊氏锥虫、鸡源贝氏隐孢子虫 和新孢子虫；图4为本发明弓形虫LAMP检测方法实时定量扩增曲线。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1采用本发明提供的引物检测弓形虫，包括如下步骤(1)弓形虫DNA的提取按照常规方法进行，参见中文版《分子克隆实验指南》(第三版)第461页-第512 页。(2)环介导等温扩增反应①按照下表加入各反应组分； ②于水浴锅或金属恒温加热器上，60_65°C (所有反应温度均为60_65°C )放置 20-90分钟，取出。(3)结果判定①琼脂糖凝胶电泳检测通过2%琼脂糖凝胶电泳，然后在成像仪下观察LAMP典 型梯形条带出现与否判定结果。出现LAMP典型梯形条带，结果为阳性(图1)。
②显色检测反应结束后，可向PCR反应管加入1000X稀释的SYBR Green I 1 u L, 震荡摇勻，观察颜色变化判断，出现绿色荧光为阳性结果，棕色为阴性结果(图2)。(4)特异性检测按照上述相同的方法，分别对艾美耳球虫、伊氏锥虫、鸡源贝氏隐孢子虫和新孢子 虫样本进行检测，结果如图3所示。实施例2采用弓形虫LAMP检测方法进行实时定量扩增反应，用LA-200实时浊度仪检测扩 增结果。结果如图4所示，其中横坐标表示时间，纵坐标表示浊度，1-7表示弓形虫DNA模板 浓度分别为 lOOng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、100fg。结果显示，模板DNA的浓度高低与LAMP扩增在时间上是成正比的，模板浓度高的 LAMP反应，其扩增产物较早被检测到。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
一种用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物，包括与弓形虫AF146527重复区基因结合的内侧引物对和与弓形虫AF146527重复区基因结合的外侧引物对，其特征在于，所述内侧引物对包括内侧上游引物FIP15′-CCGGTGTCTCTTTTTCCACCCTTCGGAGAGGGAGAAGATGTT-3′，内侧下游引物BIP15′-CCTCGTGGTGATGGCGGAGATCCCTTCGTCCAAGCCTC-3′；以及内侧上游引物FIP25′-CGGTGTCTCTTTTTCCACCCTTTTTTCGGAGAGGGAGAAGATGTTT-3′，内侧下游引物BIP25′-CTCGTGGTGATGGCGGAGATTTTCGTCCAAGCCTCCGACTCTG-3′；所述外侧引物对包括外侧上游引物F35′-GTTGGGAAGCGACGAGAG-3′，外侧下游引物B35′-ACAGTGCATCTGGATTCCTC-3′；以及外侧上游引物F3′5′-GTTGGGAAGCGACGAGAG-3′，外侧下游引物B3′5′-CAGTGCATCTGGATTCCT-3′。
2.权利要求1所述的引物在检测弓形虫中的应用。
3.—种检测弓形虫的方法，该方法包括1)提取弓形虫DNA ；2)利用权利要求1所述的 内侧引物对和外侧引物对进行环介导等温扩增反应；3)结果检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应体系如下
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的条件为 60-65°C, 20-90 分钟。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述结果检测的方法包括琼脂糖凝胶电 泳法或显色法。
7.含有权利要求1所述用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物的试剂盒。
全文摘要
本发明提供了两套用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物，其是根据弓形虫RH株的保守基因，AF146527基因(序列如Seq ID No.1所示)设计的两套引物，包括与弓形虫AF146527重复区基因结合的内侧引物对和与弓形虫AF146527重复区基因结合的外侧引物对。采用本发明提供的引物进行弓形虫检测，特异性和灵敏度高，可检测出100fg的弓形虫DNA；与PCR检测方法相比，本发明提供的环介导等温扩增检测方法，不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属或水浴锅即可；检测结果使用荧光染料即可判定，操作简单方便；本发明的引物可应用于基层现场进行的临床医学检测，特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。
文档编号C12Q1/68GK101845505SQ201010198530
公开日2010年9月29日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者孙希萌, 索勋, 贺光 申请人:中国农业大学