专利名称：检测布鲁氏菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测布鲁氏菌的方法
技术领域：
本发明涉及检测布鲁氏菌的试剂及布鲁氏菌的检测方法，尤其涉及复合探针布鲁 氏菌标识基因进行扩增，进而利用荧光PCR技术检测布鲁氏菌的方法。
背景技术：
布鲁氏菌病(布病)由布鲁氏菌引起的人畜共患自然疫源性传染病。布鲁氏菌可 感染人类、多种家畜和野生动物，引起发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害。人类感染 布病后，由于其病程较长，迁延不愈而导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。近年 来，由于家畜饲养量逐渐增加，产品流通日益频繁，人间和畜间的布病疫情在相当大范围又 出现大幅回升。传染病预防控制的最关键技术环节就是建立病原体检测的实验室诊断方法，能准 确、高效地检出与监测病原体。布鲁氏菌的检测目前仍然主要是依靠细菌培养和血清学方 法来鉴定。这些方法普遍存在检测时间长，操作繁琐，方法的敏感性差，影响因素较多等不 足，不能满足快速准确的需求。传统PCR技术和核酸杂交技术的发现大大的推动了细菌检 测技术的发展，但存在容易交叉污染、无法定量分析等缺陷。实时荧光定量PCR技术解决 了传统PCR技术的不足，已经成为细菌等微生物快速定量检测的首选技术。定量PCR技 术可在同一管内实现DNA的扩增和同步检测，而无需在PCR后进行凝胶电泳分析，具有高 效、快速、特异的优点，非常适用于单一病原体的检测。Taqman探针、分子信标、杂交探针 (Lightcycler)等用广泛应用于传染病病原体监测、食品安全、卫生检疫等领域中。发展快 速、敏感、特异、系统的病原微生物的筛查技术、方法和试剂，发展先进、系统的病原微生物 分离和检测方法，可以有效地对传染病的暴发和流行进行早期预警、快速确认，控制新发传 染病的口岸传入，并可有助于提高对突发公共卫生事件、暴发疫情和不明原因疾病的快速 应急反应和处理能力。
发明内容
本发明的第一个目的在于针对当前常规布鲁氏菌检测方法的不足，提供一种检测 布鲁氏菌的试剂，可以用于快速准确地检测布鲁氏菌。为此，本发明采用以下技术方案它 包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；上游引物的基因序列BRFl为5' -caagggcaaggtggaagatt-3‘，其基因序列如序 列表SEQ NO 1所示；下游引物的基因序列BRRl为5' -ctgcgaccgatttgatgttt-3‘，其基因序列如序 列表SEQ NO 2所示；荧光探针的基因序列FPBRl 为5' -fam-atcgtttccgggtaaagcgtcgcca-P-3 ‘，其 基因序列如序列表SEQ NO 3所示；淬灭探针的基因序列QPBRl 为5' -cgctttacccggaaacga-Dabcyl-3‘，其基因序列如序列表SEQ NO 4所示。本发明另一个目的是提供一种复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法，可以 快速准确地检测布鲁氏菌。为此，本发明采用以下技术方案它采用直接水煮法提取布鲁氏菌基因组DNA 取50μ 1的细菌样品，置于沸水浴中 煮沸10分钟，IOOOOXg离心2分钟，取2 μ 1上清作为扩增模板；所述方法的PCR 反应体系为 25 μ 1 :l(kimol/L 的 Tris-HCl，pH 为 8. 0 ；5(kimol/ L 的 KCl ；体积百分比 3% 甲酰胺；7mmol/L MgCL2 ； 100 μ mol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP ； 0. 5ymol/L的上述上游引物，0. 5ymol/L的上述下游引物，1. 5U Taq酶，100nmol/L的上述 荧光探针，200nmol/L的上述淬灭探针；PCR反应程序为预变性95°C 3min、95°C 5s、扩增的 退火温度为54°C 30s共40个循环；所述方法还包括以下检测步骤提取样本DNA为扩增模板，按上述荧光定量PCR的 反应体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照 的扩增，其中阴性对照采用非布鲁氏菌，阳性对照采用布鲁氏菌标准株；反应结束后，将样 本循环阈值C(t)与荧光定量PCR标准曲线对照，就得到样本DNA中的靶基因片段拷贝浓 度；按照靶基因片段拷贝浓度判断样本中布鲁氏菌的浓度。本发明相对于传统的布鲁氏菌检测技术，具有操作简便，高效、快速、特异的优点。 BCSP31基因编码31KDa的布鲁氏杆菌表面蛋白，具有种属特异性，可作为布鲁氏菌的核酸 诊断标志，与整个genebank数据库进行BLAST检索，发现其只对布鲁氏菌上的BCSP31基因 序列特异，和其它物种的核酸序列无同源，保证了检测方法的特异性。该方法大大缩短了布 鲁氏菌的检测时间，对样本的定量检测只需2小时左右即可完成，对布病的早期诊断具有 重要意义。
图Ia为实施例1中组合1的检测同一模板的实时扩增曲线图，其中，1为 ATCC25840的实时扩增曲线，2为B. abortus 2308的实时扩增曲线。图Ib为实施例1中组合2的检测同一模板的实时扩增曲线图，其中，1为 ATCC25840的实时扩增曲线，2为B. abortus 2308的实时扩增曲线。图2实施例2中质粒参考品的灵敏度分析实时扩增图，其中，1为IX IO6个拷贝/ μ 1的实时扩增曲线，2为IXlO5个拷贝/ μ 1的实时扩增曲线，3为IXlO4个拷贝/ μ 1的 实时扩增曲线，4为IX IO3个拷贝/ μ 1的实时扩增曲线，5为IXlO2个拷贝/ μ 1的实时扩 增曲线，6为IXlO1个拷贝/μ 1的实时扩增曲线，7为1X10°个拷贝/μ 1的实时扩增曲 线。图3为本发明实施例2绘制的荧光定量PCR标准曲线。
具体实施例方式实施例1引物与探针的制备1.靶基因选择布鲁氏菌细胞表面蛋白31kD(Brucella Cell Surfacial Protein, BCSP31)存在 于该菌细胞表面，此蛋白由BCSP31基因编码，具有种属特异性，且高度保守，可作为布鲁氏菌的核酸诊断标志，根据genbank数据库检索，获得该基因序列。2. PCR引物的设计和筛选遵循复合探针设计原则，根据BCSP31基因序列，设计了两组引物和探针。荧光探针5'端标记荧光分子FAM作为报告基团，3'端标记磷酸，以阻断其延伸。 淬灭探针的3'端连接一淬灭基团Dabcyl。为了从两组复合探针及引物组合中筛选出扩增效率高的一个组合，将这些组合进 行实时PCR分析，采用羊种布鲁氏菌标准株ATCC25840和牛种布鲁氏菌标准株B. abortus 2308为检测样本，观察它们扩增样品的能力来确定最佳组合。结果如表1和图la、图Ib所示，采用组合1进行检测时，其检测样本时的CT值较 小，而且荧光响应强度值ARFU较高，说明该组合扩增效率较高，因此，在后述的所有实验 中，均采用这个组合。表1引物及探针组合对扩增效率的影响
权利要求
1.检测布鲁氏菌的试剂，其特征在于它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭 探针；上游引物的基因序列 BRFl 为5' -caagggcaaggtggaagatt-3‘；下游引物的基因序列 BRRl 为5' -ctgcgaccgatttgatgttt-3‘；荧光探针的基因序列 FPBRl 为5' -fam-atcgtttccgggtaaagcgtcgcca-P-3'；淬灭探针的基因序列 QPBRl 为5' -cgctttacccggaaacga-Dabcyl-3‘。
2.一种复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法，其特征在于它采用直接水煮法提 取布鲁氏菌基因组DNA 取50 μ 1细菌样品，置于沸水浴中煮沸10分钟，10000 Xg离心2分 钟，取2μ1上清作为扩增模板；所述方法的 PCR 反应体系为 25 μ 1 :10mmol/L 的 Tris-HCl，pH 为 8. 0 ;50mmol/L 的 KCl ； 体积百分比 3% 甲酰胺；5mmol/L MgCL2 ； 100 μ mol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；0. 5 μ mol/ L的权利要求1所述的上游引物，0. 5 μ mol/L的权利要求1所述的下游引物，1. 5U Taq酶， 100nmol/L的权利要求1所述的荧光探针，200nmol/L的权利要求1所述的淬灭探针；PCR反 应程序为预变性95°C 3min、95°C 5s、扩增的退火温度为30s共40个循环；所述方法还包括以下检测步骤提取样本DNA为扩增模板，按上述荧光定量PCR的反应 体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩 增，其中阴性对照采用非布鲁氏菌，阳性对照采用羊种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌；反应结束 后，将样本循环阈值C(t)与荧光定量PCR标准曲线对照，就得到样本DNA中的靶基因片段 拷贝浓度；按照靶基因片段拷贝浓度判断样本中布鲁氏菌的浓度。
3.如权利要求2所述的一种荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法，其特征在于荧光定量 PCR标准曲线采用以下步骤制得将克隆有目的基因片段的质粒作为标准品DNA扩增模板，取不同DNA载量的质粒标准 品各2μ 1，按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增； 反应结束后根据得到的各个浓度的循环阈值C(t)，采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准 曲线。
全文摘要
本发明提供了一种检测布鲁氏菌的试剂，它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；上游引物的基因序列为5′-caagggcaaggtggaagatt-3′；下游引物的基因序列为5′-ctgcgaccgatttgatgttt-3′；荧光探针的基因序列为5′-fam-atcgtttccgggtaaagcgtcgcca-P-3′；淬灭探针的基因序列为5′-cgctttacccggaaacga-Dabcyl-3′。本发明还提供一种利用上述试剂的复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法。本发明具有操作简便，高效、快速、特异的优点，大大缩短了布鲁氏菌的检测时间，对样本的定量检测只需2小时左右即可完成，对布病的早期诊断具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102146466SQ20111003839
公开日2011年8月10日 申请日期2011年2月15日 优先权日2011年2月15日
发明者吕沁风, 吴忠华, 李 禾, 郑伟, 黄建可 申请人:浙江国际旅行卫生保健中心