布鲁氏菌omp31抗原表位及其单克隆抗体和应用的制作方法

布鲁氏菌omp31抗原表位及其单克隆抗体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了布鲁氏菌omp31抗原表位及其抗体和应用，表位的序列为GGYIGINAGYAGGKFK。本发明还公开了识别上述表位的单克隆抗体，及上述表位与单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌病试剂或药物中的应用。
【专利说明】布鲁氏菌〇mp31抗原表位及其单克隆抗体和应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种布鲁氏菌〇mp31抗原表位，以及使用该表位刺激得到的抗布鲁氏 菌omp31蛋白单克隆抗体及其应用。

【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌病（Brucellosis)是目前世界上流行最广的人畜共患传染病之一，据世 界卫生组织统计表明，全世界每年出现50万例人布鲁氏菌病，每年造成的经济损失达30亿 美元。我国布病的流行以羊种布氏杆菌为主的混合感染，羊种占流行株的80%。
[0003] 布鲁氏菌病临床症状复杂，引起的发热、流产等病理损害易与某些常见疾病混淆； 医生很难单凭有无病畜接触史来诊断布氏菌感染，给诊断带来了一定的困难，容易导致误 诊，造成慢性感染。另一方面缺乏有效的治疗手段，抗生素的大量长期使用仍很难见效，且 容易引起耐药性问题。因此，布鲁氏菌的疫苗预防和早期快速诊断对布菌的防控具有重大 的现实意义；其中疫苗的免疫效果和布菌诊断的准确性就显得尤为重要。目前，布鲁氏菌病 的免疫制剂种类主要包括弱毒活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、抗独特性疫苗和DNA疫苗 等。
[0004] 由于热灭活菌缺乏活性抗原刺激，不能在体内诱发可检测的IL-12,并且抑制 IL-12的产生，免疫效果不佳，而且死菌诱发的多是无保护力的体液免疫应答。而亚单位疫 苗虽然可起到短期的保护作用，但并不能诱发有效的长期免疫，只有活菌才能诱发细胞免 疫。
[0005] 我国主要是以布鲁氏菌弱毒菌苗株M5-90来免疫羊。它对成年羊有很好的免疫保 护效果，但会导致妊娠羊流产。〇mp31蛋白为膜孔蛋白，与弱毒菌苗株毒力相关，并含有保护 性抗原表位，其基因序列在不同的种属之间的同源性高达98%以上，在牛种菌中缺失，在羊 种和猪种之间存在大约9个核苷酸的差异，并存在氨基酸序列的改变，故omp31蛋白的单克 隆抗体可能能够鉴别诊断不同生物型的布鲁氏菌感染。若将M5-90疫苗株携带的omp31基 因全部敲除，则影响弱毒菌苗株的免疫效果。另外，由于M5-90免疫的动物和野毒菌株自然 感染的动物现有诊断方法不能鉴别，严重影响了布鲁氏菌病的检验和疫苗免疫预防。因此， 针对omp31蛋白的抗原表位进行修饰或改造标记疫苗，可建立该表位多肽ELISA诊断方法 及其诊断试剂，进而解决布鲁氏菌病鉴别诊断和基因工程标记弱毒菌苗株的技术难题。


【发明内容】

[0006] 本发明的一个目的在于提供一种布鲁氏菌omp31抗原表位。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供上述omp31抗原表位在制备布鲁氏菌病诊断试剂 中的应用。
[0008] 本发明的又一个目的在于提供由上述表位刺激产生的单克隆抗体。
[0009] 本发明的再一个目的在于提供上述单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌 病诊断试剂或药物中的应用。
[0010] 本发明所采取的技术方案是： 布鲁氏菌〇mp31抗原表位，其序列为GGYIGINAGYAGGKFK ( SEQ ID N0:6)。
[0011] 一种抗布鲁氏菌〇mp31蛋白的单克隆抗体，其制备方法为： 1) 将权利要求1所述的布鲁氏菌〇mp31抗原表位免疫动物； 2) 取经免疫的动物脾细胞与瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗布鲁氏菌omp31蛋白的杂 交瘤细胞； 3) 收集、纯化杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，即为抗布鲁氏菌omp31蛋白的单克隆抗 体。
[0012] 作为优选的，所述单克隆抗体的重链为IgM、轻链为K链，该单克隆抗体能与上述 的布鲁氏菌抗原多肽特异性结合。
[0013] 作为优选的，产生免疫反应的动物的血清间接ELISA效价不低于1 :51200。
[0014] 本发明的有益效果是： 本发明的〇mp31抗原多肽能有效激活分泌INF-γ的T细胞，推测该抗原多肽为 omp31 T和B淋巴细胞重叠表位，偶联之后可用于检测羊血清中的布鲁氏菌病，建立 Peptide-ELISA检测方法。本发明的单克隆抗体，对omp31蛋白具有很好的特异性识别能 力，可以精确地识别布鲁氏菌的表位。本发明的〇mp31抗原多肽极其单克隆抗体可用于制 备诊断、预防或治疗布鲁氏菌病的试剂或药物。

【专利附图】

【附图说明】
[0015] 图1是PCR扩增目的序列的电泳图； 图2是omp31重组蛋白表达电泳鉴定图； 图3是omp31重组蛋白纯化电泳鉴定及Western-Blot血清鉴定图； 图4是Western-Blot试验检测单克隆抗体omp31-2D2与布鲁氏菌疫苗株M5-90中提 取的天然膜蛋白的反应性结果图； 图5是多肽-ELISA测定单克隆抗体株omp31-2D2抗原表位结果图； 图6是ELLISpot检测分泌INF- γ T细胞水平结果图； 图7是间接免疫荧光试验检测单克隆抗体omp31-2D2与感染带有omp31基因的慢病毒 的293FT细胞反应性结果图； 图8是酶免疫染色试验检测单克隆抗体omp31-2D2与羊种布鲁氏菌菌涂片反应性结果 图。

【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例，进一步说明本发明。
[0017] 本发明使用的布鲁氏菌M5-90疫苗株购自兰州兽医研究所，为本行业所公知的疫 苗株。
[0018] omp31重组蛋白表达载体的构建 以新疆石河子大学陈创夫教授提供的布菌基因组为模板扩增目的基因序列，利用 GenBank 中提供的羊布鲁氏菌omp31 基因序列，GenBank accession No. gi|333601402,用 生物学软件〇lig〇7设计引物扩增截短N端19个氨基酸信号肽的omp31基因，选用PET-30a 载体，分别在5'端和3'端引入Nde I及Xho I酶切位点，斜体加粗为酶切位点。
[0019] 上游引物 F : 5-GGAATTra7?7^GCCGACGTGGTTG-3 (SEQ ID N0:28 ) 下游引物R:5-CCG?77ΓG^GAACTTGTAGTTCAGAC-3(SEQIDN0:29) PCR 扩增目的基因：25 μ L 体系包括 dNTP 1· 5 μ L，10XPCR Buffer 2· 5 μ L，PI、P2 各 〇· 5 μ L，模版 DNA1 μ L，Fast Star 酶 0· 5 μ L，H20 18. 5 μ L。PCR 反应条件为：95 °C预变性 2min，95 °C 45s，50 °C 30s，72 °C 70s，扩增 30 个循环后，72 °C延伸 lOmin。PCR 结果 在1%琼脂糖凝胶上电泳检测(见图1，由图1可知目的基因片段680bp)，并用胶回收试剂盒 回收。将PCR产物与克隆载体pMD19-T连接并按照pMD19-T载体说明书进行，感受态的制 备、转化与阳性克隆的鉴定均按《分子克隆（第三版）》操作。挑取PMD19-T/ omp31阳性 克隆交由英潍捷基(上海）贸易有限公司。测序成功后，用Nde 1/ Xho I双酶切pMD19-T/ omp31，回收小片段即为目的基因片断。与经过相应核酸内切酶双酶切的pET-30a质粒连 接，连接产物转入大肠杆菌DH5 α，阳性克隆提取质粒经PCR扩增及Nde 1/ Xho I双酶切 鉴定后，交由英潍捷基(上海)贸易有限公司。测序正确，成功构建表达载体pET-30a-〇mp31。
[0020] 布鲁氏菌重组膜蛋白omp31的制备 将构建的重组质粒pET-30a-〇mp31 (新疆石河子大学陈创夫教授惠赠）转化感受态 BL21。将重组菌摇至对数生长期后，以终浓度ImM IPTG加入诱导目的蛋白表达。诱导后超声 破碎，经鉴定目的蛋白主要处于沉淀中。将包涵体以2M尿素浓度的包涵体洗涤液（1 XPBS， 2M脲，0. 5% TritonX-100，lmmol/L EDTA，pH8. 0)洗涤后，目的蛋白纯度达85%以上。将洗 涤后的沉淀用6M盐酸胍（1XPBS，6M盐酸胍，pH8.0)溶解后进行梯度透析复性，复性后将 蛋白浓缩并测定蛋白浓度并用Western Blot分析其免疫原性(见附图2, 3,图2, Μ :蛋白分 子质量标准；1 :〇. 2 mM IPTG诱导破菌后沉淀；2 :0. 6 mM IPTG诱导破菌后沉淀；3 :1. 0 mM IPTG诱导破菌后沉淀；4 :重组子未诱导全菌对照；5 :0. 2 mM IPTG诱导破菌后上清；6 :0. 6 mM IPTG诱导破菌后上清；7 :1. 0 mM IPTG诱导破菌后上清；图3,图A，M :marker ;1 :蛋白 复性与浓缩后上清；2 :洗涤后未溶解包涵体；图B，1 :一抗为免疫羊阳性血清；2 : -抗为阴 性血清)。
[0021 ] 当然，也可以使用其他方法制备得到的布鲁氏菌重组膜蛋白omp31，或直接购买纯 化的布鲁氏菌重组膜蛋白〇mp31。
[0022] 制备重组膜蛋白omp31的单克隆抗体 1.小鼠免疫 1) 选择6周龄的纯系雌性BALB/c小鼠，用纯化的重组omp31蛋白作为免疫抗原免疫小 鼠，将omp31蛋白与等体积的弗氏完全佐剂（CFA)乳化后，背部或腹腔皮下多点注射； 2) 初次免疫后2周将纯化的omp31与等体积的弗氏不完全佐剂（IFA)乳化后，背部或 腹腔皮下多点注射； 3) 2周后，小鼠尾部取血，离心获得血清将血清倍比稀释采用间接-ELISA方法测效价， 效价需不低于1 :51200 ; 4) 融合前三天，腹腔注射omp31蛋白； 三次免疫抗原的量分别为1〇〇 μ g/鼠、50 μ g/鼠、50 μ g/鼠。
[0023] 2.细胞融合 断颈处死上述免疫好的BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按 5:1在50% PEG4000融合剂下融合，融合后以HAT选择培养基铺板置于37°C 5%C02培养。
[0024] 3.阳性克隆筛选及克隆 利用纯化的重组〇mp31蛋白以间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，将阳性孔扩大 培养后，用有限稀释法进行细胞克隆，经过三次克隆获得1株能稳定传代并分泌抗〇mp31蛋 白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株〇mp31-2D2。
[0025] 单克隆抗体的鉴定 1.单克隆抗体的亚类鉴定 参照Hycult Biotechnol公司鼠源抗体分型试剂盒说明书对杂交瘤细胞omp31-2D2进 行鉴定，经鉴定〇mp31-2D2重链为IgM，轻链为κ链。
[0026] 2. Western-Blot 鉴定 按Bio-rad膜蛋白提取试剂盒说明书提取布鲁氏菌M5-90疫苗株膜蛋白，提取后膜蛋 白按1:1加入2XSDS上样缓冲液，沸水浴中煮5min，12000rpm离心lmin，取上清10 μ 1进 行分离胶12%，浓缩胶5%的SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜上，PVDF膜以含5%脱 脂奶粉TBST封闭2h，随后以各株单抗的细胞上清1:3稀释孵育lh，TBST洗膜三次，每次 lOmin ;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG & IgM作为二抗孵育lh，TBST洗膜后发光显影。 试验中以HCV NS3的一株单抗作为阴性对照。试验结果显示omp31-2D2与天然膜蛋白在约 为31KDa处有一明显条带，而阴性对照HCV NS3的单抗不与膜蛋白反应（图4)。
[0027] Peptide-ELISA鉴定单克隆抗体omp31_2D2抗原识别表位 根据pET-30a-〇mp31测序结果设计并合成了 27条重叠肽，长度11?16个氨基酸， 每两条多肽之间重叠7个氨基酸(包括所有< 8个氨基酸残基的表位）（表1)。重组蛋白 omp31以及27条重叠多肽0MP31 (P01-P27)每条多肽终浓度5 μ g/ml，每孔100 μ 1包被过 夜；洗涤液PBST洗涤4次后，以PBS+4%BSA，每孔200 μ 1 37°C封闭一小时；洗涤液洗涤4次 后，以50 μ 1各单克隆抗体株细胞上清+50 μ 1抗体稀释液（PBST+1%BSA)为一抗37°C孵育 45min ;洗涤液洗涤6次后，1:10000抗体稀释液稀释的HRP标记羊抗鼠 IgG+IgM为二抗，每 孔100μ 1，37°C孵育30min ;洗涤液洗涤6次后，加入ΤΜΒ-Η202，每孔100μ 1避光显色10min， 每孔50μ1 2M H2S0^S止反应。测量450nm波长下每孔的光密度（0D)。以杂交瘤细胞SP2/0 细胞上清作为抗体对照，以重组蛋白〇mp31作为抗原对照。以待测孔0D450nm彡2. 1倍阴 性对照0D450nm判为阳性。经过测定，单抗omp31-2D2和P06特异性反应。
[0028] 表1.重叠 7个氨基酸的合成多肽 Peplide Sequence PCbn KKQ ID KO; Fill ΙΙ·Λ?ΛΛΜ M2 1 FCI2 LASIAAXfF：YrSAMAA0 6-21 2 ?ΠΒ I'SAMAADVVVHHPSAF 15*30 3 PCM VSHPSAFrAAmyrFS 24-39 4 P05 /Wn-l.yrFSWTC.iGYlGK 33-48 5 mm ?κ?γκηκΑ--ΥΛ?Κ?κψκ 4247 e IH)7 YAOCIKFKIIPFSSFDKE 51-66 7 130S FHSFDKKDNl^QVSGSL 6CK75 li P09 EyVSGSUWTAGGFVG 69-M 9 Is 10 l；'\<Ki!-:\XiCn-Q.\GYN\VQ 7K?93 10 Ι?Ι QA(l^^NWQI J)XG V\1 XiA K7^102 II 1?2 KCiVVIXIAKTl)F(JCiS^V 96*111 12 IJI3 DF^CtSSVTGSISAGAK 105-120 13 PI4 SlSAik\m-LEQKAETK 114-129 14 P15 ECjKAHTRVHWFCillliA 123-08 15 F16 \VFCrr\'RARl.iiYl1AlT：R 132?14? 16 PI7 GY 丁ATERLM'TGTOOL 141-156 17 HH VYCri'OCiLAYClKVKSAf 150165 IX P19 CiK\?KSAFKLXjDDASAI., 159-174 19 P20 ODDAMUrrWSDKTKA K泰 IS3 20 P2I WSDKTK...UiWTI-XL.W-L 讯 177^192 21 P22 11..,a:\(i.\iiY,\KXXWTL 186-20! 22 P23 iKSKwnKmiYixrm, 195*210 23 ￥24 KYLYTDIXIKRXI.VDVD 204-219 24 P2$ RXI.VOX ONSFLHXKVN 213?22X 25 Ρ2? FLESK^'KFirrVRVCiLN 222-137 26 ls27 1?ΚΥ(ι1Λ"ΥΚΙ:， 231-240 27 ELI Spot检测分泌IFN- γ T细胞水平 于羊免疫M5-90减毒活疫苗前与免疫后1，2, 2. 5个月使用多肽刺激羊PBMC检测分泌 IFN-γ的细胞数量，以反映对应时间的T细胞反应应答水平。步骤如下： ⑴包板：取〇.5mg/ml bIFN-γ- I 150ul以灭菌的PBS稀释至10ml;将ELISpot板 取出，以50ul/孔70%乙醇孵育2min，倒掉；以灭菌水200ul/孔洗涤5次；lOOul/孔抗体 稀释液，4°C冰箱过夜。
[0029] (2)封闭：去除包被液，灭菌的PBS洗涤5次；200ul/孔R10细胞培养箱内37°C， 5% C02 孵育 lh。
[0030] (3)外周血单核细胞分离及细胞铺板：肝素钠抗凝管颈静脉采血20ml，将新鲜采 集的血液以RPMI1640培养基稀释一倍，于5个15ml离心管中分别加入4ml人淋巴细胞分 离液，沿着管壁缓慢加入8ml稀释后的血液，805 X g离心40min，吸取白膜层合至一新15ml 离心管中，加入适量RPMI-1640培养基，400Xg离心6min。离心后以适量RM10重悬，细胞 计数后将细胞稀释至4X106 cells/ml,按照每孔50μ 1加入板内，然后将浓度为20μ g/ml 肽池或多肽稀释液按照每孔50 μ 1加入孔内，不混匀不震荡，直接放于细胞培养箱内37°C， 5% C02培养18h，期间严禁移动。
[0031] (4)检测抗体孵育与显色：倒掉板内的细胞，并以200 μ 1/well PBS洗涤5次；取 0.5mg/ml PAN-BIOTIN 5ul 稀释至 10ml ,ΙΟΟμΙ/well 37°C孵育2h;PBS洗涤5次，以PBS 1:1000 稀释 Streptavidin-ALP 100ul/well，37°C孵育 lh;PBS 洗漆 5 次，ΙΟΟμΙ/well BCIP/NBT plus 37°C显色15min或者至BCIP/NBT plus变色；纯水终止反应并晾干。
[0032] (5)读数和质控：使用C. T. L公司的Immunospot S5 analyzer进行斑点的读取， 计数和质控；无细胞孔斑点数必须为零，否则重做；计数时通过Gating严格控制多肽空白 对照孔的斑点数不超过50 SFC/1 million cell，以去除一些非特异性斑点；将所得斑点数 进行数据转换为1〇〇万PBMC中斑点数，汇总分析。
[0033] 间接免疫荧光试验鉴定单克隆抗体omp31-2D2与感染带有omp31基因慢病毒的 293FT细胞反应 感染带有〇mp31基因慢病毒的293FT细胞于96孔板中培养16小时后，弃原培养基， 每孔100ul 4°C预冷的100%甲醇，于-20°C固定20min。弃甲醇，每孔100ul IF Buffer (0.01M ρΗ7·4 PBS+l%BSA+2.5 mM EDTA)，室温孵育 1 h。弃 IF Buffer，以 50μ1 omp31-2D2 单克隆抗体株细胞上清+50 μ 1抗体稀释液（PBST+1%BSA)为一抗4°C孵育过夜。PBS洗涤4 遍后，1 :1000抗体稀释液稀释的荧光素标记羊抗鼠 IgG+IgM每孔100ul，37°C孵育1 h ;PBS 洗涤4遍后荧光显微镜下观察。
[0034] 酶免疫染色试验鉴定单克隆抗体omp31-2D2与羊种布鲁氏菌菌涂片反应 3%过氧化氢处理菌涂片，0. 01M PH7. 4 PBS洗涤后滴加50ul omp31-2D2单克隆抗体 株细胞上清，37°C孵育1 h。PBS洗涤后滴加 PBS1:10000稀释的HRP标记羊抗鼠 IgG+IgM 50ul，37°C孵育45min。PBS洗涤后，滴加50ul DAB-H202，避光显色15min，纯水终止反应；中 性树胶封片后油镜下观察。以菌体膨大，呈黄棕色至棕黑色判定为阳性结果；不显色或仅呈 浅黄色判定为阴性。以大肠杆菌菌涂片作为抗原对照，HCV NS3单克隆抗体3E5作为抗体 对照。经鉴定，〇mp31-2D2能与羊种布鲁氏菌菌涂片反应。 〈11〇>南方医科大学 〈120>布鲁氏菌omp31抗原表位及其单克隆抗体和应用 <130> <160> 27 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT 〈213>人工序列 <400> 1 Met Lys Ser Val lie Leu Ala Ser lie Ala Ala Met 1 5 10 〈210〉 2 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 2 Leu Ala Ser lie Ala Ala Met Phe Ala Thr Ser Ala Met Ala Ala Asp 15 10 15 〈210〉 3 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 3 Thr Ser Ala Met Ala Ala Asp Val Val Val Ser Glu Pro Ser Ala Pro 15 10 15 〈210〉 4 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 4 Val Ser Glu Pro Ser Ala Pro Thr Ala Ala Pro Val Asp Thr Phe Ser 15 10 15 〈210〉 5 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 5 Ala Pro Val Asp Thr Phe Ser Trp Thr Gly Gly Tyr lie Gly lie Asn 15 10 15 〈210〉 6 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 6 Gly Gly Tyr lie Gly lie Asn Ala Gly Tyr Ala Gly Gly Lys Phe Lys 15 10 15 〈210〉 7 <211> 16 〈212> PRT 〈213>人工序列 <400> 7 Tyr Ala Gly Gly Lys Phe Lys His Pro Phe Ser Ser Phe Asp Lys Glu 15 10 15 〈210〉 8 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 8 Phe Ser Ser Phe Asp Lys Glu Asp Asn Glu Gin Val Ser Gly Ser Leu 15 10 15 〈210〉 9 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 9 Glu Gin Val Ser Gly Ser Leu Asp Val Thr Ala Gly Gly Phe Val Gly 15 10 15 〈210〉 10 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 10 Thr Ala Gly Gly Phe Val Gly Gly Val Gin Ala Gly Tyr Asn Trp Gin 15 10 15 〈210〉 11 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 11 Gin Ala Gly Tyr Asn Trp Gin Leu Asp Asn Gly Val Val Leu Gly Ala 15 10 15 〈210〉 12 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 12 Asn Gly Val Val Leu Gly Ala Glu Thr Asp Phe Gin Gly Ser Ser Val 15 10 15 〈210〉 13 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 13 Asp Phe Gin Gly Ser Ser Val Thr Gly Ser lie Ser Ala Gly Ala Ser 15 10 15 <210> 14 〈211〉 16 <212> PRT 〈213>人工序列 <400> 14 Ser lie Ser Ala Gly Ala Ser Gly Leu Glu Gly Lys Ala Glu Thr Lys 15 10 15 〈210〉 15 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 15 Glu Gly Lys Ala Glu Thr Lys Val Glu Trp Phe Gly Thr Val Arg Ala 15 10 15 〈210〉 16 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 16 Trp Phe Gly Thr Val Arg Ala Arg Leu Gly Tyr Thr Ala Thr Glu Arg 15 10 15 〈210〉 17 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 17 Gly Tyr Thr Ala Thr Glu Arg Leu Met Val Tyr Gly Thr Gly Gly Leu 15 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT 〈213>人工序列 <400> 18 Val Tyr Gly Thr Gly Gly Leu Ala Tyr Gly Lys Val Lys Ser Ala Phe 15 10 15 〈210〉 19 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 19 Gly Lys Val Lys Ser Ala Phe Asn Leu Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu 15 10 15 〈210〉 20 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 20 Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu His Thr Trp Ser Asp Lys Thr Lys Ala 15 10 15 〈210〉 21 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213>人工序列 <400> 21 Trp Ser Asp Lys Thr Lys Ala Gly Trp Thr Leu Gly Ala Gly Ala Glu 15 10 15 〈210〉 22 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 22 Thr Leu Gly Ala Gly Ala Glu Tyr Ala lie Asn Asn Asn Trp Thr Leu 15 10 15 〈210〉 23 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 23 lie Asn Asn Asn Trp Thr Leu Lys Ser Glu Tyr Leu Tyr Thr Asp Leu 15 10 15 〈210〉 24 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 24 Glu Tyr Leu Tyr Thr Asp Leu Gly Lys Arg Asn Leu Val Asp Val Asp 15 10 15 <210> 25 <211> 16 <212> PRT 〈213>人工序列 <400> 25 Arg Asn Leu Val Asp Val Asp Asn Ser Phe Leu Glu Ser Lys Val Asn 15 10 15 〈210〉 26 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 26 Phe Leu Glu Ser Lys Val Asn Phe His Thr Val Arg Val Gly Leu Asn 15 10 15 〈210〉 27 〈211〉 10 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 27 Thr Val Arg Val Gly Leu Asn Tyr Lys Phe 1 5 10
【权利要求】
1. 布鲁氏菌〇mp31蛋白抗原表位，其序列为GGYIGINAGYAGGKFK ( SEQ ID N0:6)。
2. 权利要求1所述布鲁氏菌omp31蛋白T细胞表位在制备布鲁氏菌病诊断试剂或治疗 药物中的应用。
3. 抗布鲁氏菌omp31蛋白的单克隆抗体，其制备方法为： 1) 将权利要求1所述的布鲁氏菌〇mp31蛋白T细胞表位免疫动物； 2) 取经免疫的动物脾细胞与瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗布鲁氏菌omp31蛋白的杂 交瘤细胞； 3) 收集、纯化杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，即为抗布鲁氏菌omp31蛋白的单克隆抗 体。
4. 根据权利要求3所述的抗布鲁氏菌omp31蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单 克隆抗体的重链为IgM、轻链为κ链，该单克隆抗体能与权利要求1所述的布鲁氏菌 omp31 蛋白T细胞表位特异性结合。
5. 根据权利要求3所述的抗布鲁氏菌omp31蛋白的单克隆抗体，其特征在于：产生免 疫反应的动物的血清间接ELISA效价不低于1 :51200。
6. 权利要求3?5任一项所述的单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌病试剂 或药物中的应用。
7. 稳定分泌权利要求3?5任一项所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
8. 分泌权利要求3?5任一项所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株omp31-2D2。
【文档编号】C07K14/23GK104086634SQ201410259448
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月11日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】王文敬, 吴静波, 廖卿宇, 黎诚耀 申请人:南方医科大学