大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属大熊猫蛔虫病防治研究領域，涉及ー种西氏贝蛔虫抗原以及该抗原的制备及其应用。
背景技术：
大熊猫作为我国的国宝和野生动物保护的旗舰物种，被公认为全球最为濒危的物种之一，其目前仅分布于青藏高原以东的秦岭、名山、大相岭、小相岭及凉山5个山系，种群数量为2，500-3，000。西氏贝蛔虫(Baylisascaris schroederi)是大熊猫 体内最为常见的一种肠道寄生虫，对野生和圈养大熊猫危害极大。西氏贝蛔虫成虫通常寄生于大熊猫的肠道内，但偶尔也可出现于大熊猫的口腔、喉、气管、胃、胰管及胆管内。因其成虫和幼虫所在位置的不同，对大熊猫造成的损害也不同。移行期幼虫可引起广泛而严重内脏幼虫移行症(VLM)如肠炎、肠损伤以及典型蠕虫性的肝炎和肺炎，而成虫则可导致肠道堵塞、炎症甚至大熊猫的死亡。和所有其它蛔虫类似，西氏贝蛔虫主要是经ロ感染且整个发育过程无任何中间宿主。感染性虫卵经ロ摄入，卵中所含的L2期幼虫在小肠内孵出，然后穿过肠壁，移行至肝脏(L3)和肺脏(L4)，最终经咽喉回到肠道发育成熟，交配并产卵，其虫卵随粪便排除。虫卵对各种理化物质和不良环境条件具有较强的抵抗力且在潮湿的土壌里能存活数年之久，因此极易引起大熊猫的感染。在自然条件下，野生大熊猫西氏贝蛔虫的感染率可达50%以上，甚至100%，是引起野生大熊猫死亡的主要原发性和继发性病因之一。从1971年至2005年间因感染西氏贝蛔虫而导致野生大熊猫死亡的现象日趋明显，其中仅2001年至2005年5年时间由VLM造成的死亡数就占到了总死亡数了 50%。此外，最新数据显示野生大熊猫西氏贝蛔虫的自然感染率目前仍超过54. 0%。迄今为止，国内外未见任何可用的预防性疫苗，大熊猫西氏贝蛔虫病的防治仍以药物防治为主，且整个防御过程遵从多剂量、轮换用药的原则，直到大熊猫排净虫体或虫卵。然而，快速出现的耐药性虫株以及化学药物所产生的食物链和环境污染，加之自然环境下大熊猫的重复性感染迫使我们不得不寻求新的预防和控制措施。而疫苗免疫似乎是ー个理想的防控手段。先前的研究已经证实，使用紫外线照射的感染性蛔虫幼虫或者虫卵免疫动物可使动物产生较强的免疫力，抵制蛔虫的感染。另外，利用不同发育阶段蛔虫幼虫的粗提抗原也可诱导动物机体产生免疫保护カ。可惜这些方法被相应因素所局限，例如潜在的偶发性感染，如感染性蛔虫幼虫或者虫卵，以及有限数量的蛔虫天然抗原。因此，探求ー种安全实际的免疫方法成为了必要，而使用非侵染性且可大量制备的重组疫苗抗原不失为一个更好的选择。最近，几个猪蛔虫重组大肠杆菌蛋白抗原已被证实能够给予实验小鼠免疫保护カ从而抵御猪蛔虫感染性虫卵的攻击。类似的现象(西氏贝蛔虫大肠杆菌重组抗原)也被观察存在于西氏贝蛔虫——小鼠感染模型。然而截至目前，可用作西氏贝蛔虫特异的疫苗靶向性蛋白抗原数量仍很缺少；重要的是这其中所涉及的准确免疫机制仍有待进ー步确定，尽管先前发表的研究成果已表明多数胃肠道寄生性线虫感染以诱导宿主产生较强的Th2性免疫反应为主。

发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种针对西氏贝蛔虫病的安全有效的能够激发大熊猫抗西氏贝蛔虫病的抗原，以及制备该抗原的方法和该抗原的应用。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原,该抗原基因为Bsc38基因，该基因核昔酸序列如表I所不，对应氣基酸序列如表2所示。本发明还提供了上述大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原的制备方法，按照以下步骤进行
2. I提取大熊猫西氏贝蛔虫虫体总RNA，以该RNA为模板进行反转录，合成第一条cDNA，以合成的cDNA为模板进行Bsc38基因扩增；上游引物5’-TAAAGATGGCATTGGCCGCATCG-3’，下游引物5，-CACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTCA-3，；2. 2对克隆质粒进行目的片段序列測定；2. 3根据Bsc38基因所测序列，除去信号肽序列，扩增编码成熟肽核苷酸序列引物上游引物5’-CCCAAGCTTCGACAATCTCGCAGT-3’，含 HindIII 酶切位点 AAGCTT，下游引物5’-CCGCTCGAGTCACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC-3’，含 XhoI 酶切位点CTCGAG ；2.4PCR扩增产物经琼脂糖凝胶分离纯化后，与表达载体pET32a⑴一起进行HindIII和XhoI双酶切；然后将目的片段与pET32a⑴进行连接，构建表达载体pET32a(+)-Bsc38 ;重组载体被重新转入克隆菌DH5 α进行再次克隆并测序；将测序正确的重组表达质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达；表达温度选择37°C，诱导时间为5h ;离心收集表达菌株，并重悬于预冷的50mMNaH2P04 (pH 8. O) UOmM Tris-HCl (pH
8.O)、IOOmM NaCl裂解液中，按IOOmL培养物每5mL裂解液进行裂解；然后将裂解菌液进行超声处理并离心，收集沉淀，弃去上清；用SM尿素冲洗所得沉淀直至完全溶解，在含有SM尿素的变性条件下分离纯化得到重组Bsc38表达蛋白；该重组Bsc38表达蛋白即为所要制备的抗原。上述Bsc38基因扩增和编码成熟肽核苷酸序列扩增的PCR反应体系和反应程序为PCR反应体系(25 μ L) 2 μ LcDNAU. OU Taq DNA聚合酶、3. OmM MgCl2、400 μ MdNTP混合液、50 μ MlO XPCR 缓冲液(Mg2+Free)、8 μ LddH20、上下游引物各 IOpmol ；PCR 反应程序94°C 预变性 5min ;94°C 变性 30sec，62°C 退火 30sec，72°C 延伸45sec，循环扩增35次，最后72°延伸IOmin ;扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离，纯化；然后纯化产物被连接入PMD19-T载体，转感受态细胞DH5 α进行亚克隆。步骤2. 2对克隆质粒进行目的片段序列測定，測定结果已登录到DDBJ/EMBL/GenBank数据库，对应登陆号为GQ859591。本发明还提供了上述大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原的应用，将重组蛋白Bsc38用O. OlM, pH 7. 4的稀释液PBS稀释，然后与弗氏完全佐剂FCA进行等体积混合制成针剂，混合液4°C避光处理16h，以备使用。设计引物，经PCR扩增所得Bsc38基因，长1088bp，最大ORF为1083bp，编码360个氨基酸；对应分子量为40. 507kDa，等电点为6. 32。经SignalP 3. O预测，其前20个氨基酸共同形成信号肽序列；切去信号肽所得成熟分子，其分子量大小为38. 478kDa，对应等电点为6. 31。动物保护性实验结果表明该基因能够作为制备预防大熊猫西氏贝蛔虫病基因エ程疫苗的侯选基因。与现有技术相比，本发明能够减少大熊猫西贝氏蛔虫病药物防治过程中耐药性虫株的出现以及药物对食物链和环境的污染，井能够减轻自然环境下大熊猫西氏贝蛔虫的重复性感染。在国内外首次阐明了西氏贝蛔虫幼虫感染宿主后的分子免疫机制。



图I重组Bsc38蛋白的表达与Western blotting分析。图2西氏贝蛔虫内源性Bsc38蛋白及同系物的鉴定分析。图3西氏贝蛔虫内源性Bsc38在雌性成虫中的免疫组织化学分析。图4重组Bsc38蛋白与不同动物抗西氏贝蛔虫免疫血清反应活性检测分析。图5免疫组rBsc38-FCA-PBS、佐剂组FCA-PBS、空白对照组PBS小鼠攻虫后肝脏、肺脏及肝肺幼虫回收数量分析。图6rBsc38-FCA-PBS组O、FCA-PBS组ぐ、PBS组☆小鼠在三免后2周感染3，200枚西氏贝蛔虫感染性虫卵的致死率观察分析。图7免疫组rBsc38-FCA-PBS、佐剂组FCA-PBS、空白对照组PBS小鼠在攻虫前后rBsc38特异性抗体IgG/A、IgGl及IgG2a/B水平检测分析。图8免疫组rBsc38-FCA-PBS、佐剂组FCA-PBS、空白对照组PBS小鼠三免后2周细胞因子，包括Y -IFN、IL-2、IL-4、IL-10水平测定ELISA分析。图I中A :不同诱导时间下重组Bsc38蛋白的表达分析，1-6 :诱导时间分别为0h、lh、2h、3h、4h、5h，M蛋白质分子量标准，7 :透析纯化后的rBsc38 ；B :重组Bsc38蛋白的Western blotting分析,8_10 :印迹血清分别为兔抗西氏贝蛔虫血清、健康兔血清、抗rBcs38小鼠血清。图2中A :西氏贝蛔虫不同发育阶段内源性Bsc38蛋白的鉴定，1_5 :分别为rBsc38、雌性成虫、L3期幼虫、L2期幼虫、胚胎期虫卵；B Bsc38同系物蛋白在其他蛔虫中的鉴定，1-5 :分别为人蛔虫成虫、西氏贝蛔虫成虫、猪蛔虫成虫、犬弓蛔虫成虫。图3中A和C :小鼠抗rBsc38血清为ー抗，按1:100稀释;B和D :小鼠阴性血清，按1:100稀释；A和B :放大100倍；C和D放大200倍。A和C中箭头指示内源性Bsc38所在区域。图4中I :兔感染前血清；2 :兔感染血清；3小鼠感染前血清；4小鼠感染血清。图5中各组数据差异性表示分别为:*P〈0. 05，**P〈0. 01，***P〈0. 001。图6中*表示数据存在差异性P〈0. 05。图7中箭头表示攻虫时间点；*表示数据存在差异性P〈0. 001。图8中各组数据差异性表示分别为*ρ〈0· 01，**Ρ〈0· 001。
具体实施例方式下面结合实施例和附图进行说明，本实施例仅以试验小鼠和兔作为实施对象以说明Bsc38抗原的实用性。本实施例制备的抗原，其基因为Bsc38基因，该基因核昔酸序列如表I所不Bsc38编码成熟肽的核苷酸序列，对应氨基酸序列如表2所示。I、RNA的提取与Bsc38基因的扩增提取西氏贝蛔虫虫体总RNA，所提RNA浓度约I μ g/ μ L，以提取的5 μ L总RNA为模板，0igo(dT)18为反转录引物，进行第一条cDNA的合成。然后以合成的cDNA为模板进行Bsc38基因的扩增；扩增引物设计如下上游引物5’-TAAAGATGGCATTGGCCGCATCG-3’，下游引物5’-CACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC A-3’， PCR 反应体系(25 μ L)为2 μ LcDNA、I. OU Taq DNA 聚合酶、3. OmM MgCl2,400 μ MdNTP 混合液、50 μ MlO XPCR 缓冲液(Mg2+Free)、8 μ LddH20、上下游引物各 IOpmol。PCR反应程序为94°C预变性5min ;94°C变性30sec，62°C退火30sec，72°C延伸45sec，循环扩增35次，最后72°延伸lOmin。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离后进行纯化；然后纯化产物被连接入PMD19-T载体，转感受态细胞DH5 α进行亚克隆。2、DNA序列分析对上述克隆质粒进行目的片段序列測定。该目的片段已登录到DDBJ/EMBL/GenBank数据库，对应登陆号为GQ859591。3、重组蛋白Bsc38的表达与纯化根据上述Bsc38基因所测序列，除去信号肽序列，设计扩增编码成熟肽核苷酸序列引物上游引物5’-CCCAAGCTTCGACAATCTCGCAGT-3’，含 HindIII 酶切位点 AAGCTT，下游引物5’-CCGCTCGAGTCACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC-3’，含 XhoI 酶切位点CTCGAG ；PCR反应体系和反应程序參考上述I部分，模板为测序正确的亚克隆质粒。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶分离纯化后，与表达载体pET32a(+) —起进行HindIII和XhoI双酶切；然后将目的片段与pET32a(+)进行连接，构建表达载体pET32a(+)-Bsc38。重组载体被重新转入克隆菌DH5a进行再次克隆并测序。将测序正确的重组表达质粒转入表达宿主菌BL21 (DE3)进行IPTG诱导表达，终浓度为ImM ;表达温度选择37°C，诱导时间为5h。离心收集表达菌株，并重悬于预冷的 50mM NaH2PO4 (pH 8. O) UOmM Tris-HCl (pH 8. O)、IOOmM NaCl裂解液中，按IOOmL培养物每5mL裂解液进行裂解；然后将裂解菌液进行超声处理并离心，离心转速为1，2000r/min,时间15min,收集沉淀,弃去上清。用8M尿素冲洗所得沉淀直至完全溶解。重组Bsc38表达蛋白在含有SM尿素的变性条件下被分离纯化；其纯化物经超滤浓缩后被梯度透析，尿素浓度分别为8M、6M、4M、3M、2M、1M、PBS。透析产物浓度被测定并被等量分装存于-70°C，待使用。所述成熟肽核苷酸序列见表1，与该成熟肽核苷酸序列相对应的氨基酸序列如表2所示。4、免疫血清的制备用现有方法进行兔抗西氏贝蛔虫免疫血清的制备。小鼠抗重组Bsc38蛋白多克隆抗体的制备方法如下所述10只雌性小鼠皮下接种重组Bsc38与FCA混合疫苗，50 μ g/只，2周后重复一次，共两次。最后一次免疫后2周，采血分离血清，经琼脂糖扩散试验检测其效价达1:32后于-20で保存。5、免疫印迹寄生虫抗原以及重组Bsc38蛋白先分别经10%的SDS-PAGE电泳后，电转入硝酸纤维膜(NC膜)上，并于室温在5%BSA中孵育Ih。对于虫体内源性Bsc38的检测，上述NC膜将与小鼠或兔抗rBsc38血清进ー步孵育；而对于重组Bsc38蛋白抗原性的检测，上述NC膜则需要与小鼠或兔抗西氏贝蛔虫感染血清、小鼠抗rBsc38血清及兔正常血清孵育。经ー抗孵育后，弃ー抗，用TBS-T洗膜，5minX3次；加入碱性磷酸酶偶联羊抗鼠或羊抗兔ニ抗，按I 200比例用TBS-T稀释，室温孵育2h ;弃去ニ抗，用TBS-T洗膜3次，每次5min ;加入显色液 nitroblue tetrazol ium/5-bromo-4-chloro-3-in-doIylphosphate(NBT/BCIP),避光 显色直至印迹带出现，然后放入ddH20终止显色反应。6、内源性Bsc38在雌性成虫虫体中的免疫定位用4%多聚甲醛溶液，含O. IM磷酸缓冲液pH=7. 2，对一条西氏贝蛔虫雌性成虫虫体进行4°C过夜固定处理，然后包埋入蜡。虫体横切面经脱蜡和梯度脱水处理后，用PBS液侵泡。3%H202被用于灭活内源性的过氧化物酶，而含10%山羊血清的PBS液则被用于封闭非特异性的抗原位点，室温作用10-15min。随后在组织切片上滴加稀释的小鼠抗rBsc38血清，稀释倍数1:100，而对照组则滴加同样稀释倍数的健康小鼠血清，室温共同作用lh，抛去载破片上残余血清，将载破片放入PBS中洗涤3次，每次5min。抛去多余PBS后滴加生物素化的山羊抗小鼠标记IgG ニ抗1:1000，然后置于室温2011^11，？85冲洗载破片，51^11\3次；抛干PBS,在光学显微镜下滴加显色底物3’，3’_diaminobenzidinetetrahydrochloride并控制显色时间。如达到理想效果，可用蒸馏水洗涤，終止显色反应。蒸馏水洗涤IOmin后，用苏木精复染30sec,蒸懼水洗漆IOmin,常规方法脱水、ニ甲苯透明、中性树胶封片,镜检。7、免疫保护试验先将重组Bsc38蛋白稀释至600yg/mL，稀释液PBS，0. 01M，pH 7. 4，然后与弗氏完全佐剂FCA进行等体混合，混合液4°C避光处理16h。整个保护性试验设置FCA-PBS和PBS两个对照组。健康小白鼠90只，随机分成3组，每组30只，分别为rBsc38-FCA-PBS组、FCA-PBS组和PBS组。三组小鼠分别进行皮下注射rBsc38-FCA-PBS、FCA-PBS和PBS，注射剂量为IOOyL/只。首次注射后两周，各组分别实施第一次和第二次加强免疫，两次免疫间隔时间为14d。最后一次免疫之后2周，每组随机挑选10只小鼠，采集其脾脏进行淋巴因子试验，而各组剩余20只小鼠则通过人工灌胃方式感染3，200枚西氏贝蛔虫感染性虫卵。攻虫后一周，各组随机挑选10只小白鼠，分别采集其肝脏和肺脏，并用外科手术刀进行捣碎，使用贝尔曼法收集每组小鼠肝肺幼虫，在显微镜下观察和记录所得幼虫数。每组最后10只小白鼠则被用于西氏贝蛔虫致死性观察，观察期设为攻虫感染后的80d内。rBsc38-FCA-PBS组小鼠的相对存活率RPS使用如下公式计算RPS= {I-(rBsc38-FCA-PBS组小鼠致死率/PBS组小鼠致死率)} X100。整个动物保护性试验设计被展示见表3。另外，用于抗体检测的血清样品采集分别在每次免疫之后以及攻虫后的0d、7d、21d、35d、42d和49d进行，且所用样品随即储存于_20°C条件，待用。8、ELISA 检测抗体免疫组小鼠血清中rBsc38特异性抗体IgM、IgE、IgG及IgG亚型(IgGl和IgG2a)的測定使用酶联免疫吸附试验ELISAs。其中，IgM、IgG及IgG亚型抗体水平的測定使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体作为ニ抗，对应的亲和纯化山羊抗小鼠IgM、IgG、IgGl和IgG2a被用作标准对照。用O. IM碳酸盐缓冲液(IOmM Na2CO3, 30mM NaHCO3 ；pH 9. 6)稀释成的2 μ g/mL rBsc38蛋白包被于96孔ELISA板，100 μ L/孔，置于4°C冰柜孵育14 16h，然后用O. 05%Tween20 (PBS-T)洗涤3次，每次5min，再加2%PBS溶解的BSA进行封闭，100 μ L/孔，37°C作用 2h，用 PBS-T 洗涤，5minX3 次，加入 PBS(0.01M，pH 7.4)按 1:2000 稀释小鼠血清，100 μ L/孔，370C孵育Ih,再用PBS-T洗涤3次，每次5min，抛干，加入PBS (O. 01M, pH7. 4)稀释的山羊抗小鼠 IgM-HRP (1:5000)、IgG-HRP (1:5000)及 HRP 偶联 IgG亚型(I: 5000)酶标ニ抗，100 μ L/孔，370C孵育lh, PBS-T洗涤，5minX 3次，抛干，加入底物溶液O. 4mg/mL OPD, 50mM 磷酸氢ニ钠，25mM 枸櫞酸 and 30%H202, 100 μ L/ 孔，37°C作用 5 lOmin，加入 100 μ L终止液2Μ H2SO4终止反应。rBsc38特异性抗体IgE的測定，使用抗体捕获性ELISA检测法。大鼠抗小鼠IgE抗体作为捕获性抗体，而大鼠抗小鼠IgE单克隆抗体(按1:10，OOO稀释)则被用作标准对照。包被有相同浓度rBsc38 (2 μ g/mL)的96孔ELISA板先后与待测血清(按1: 1，000)和大鼠抗小鼠IgE单克隆抗体(I: 10，000)进行37°C孵育，时间均为lh，然后PBS-T洗涤，各3次，每次5min，抛干，加入HRP标记的山羊抗大鼠IgG ニ抗，37°C作用lh，用PBS-T洗涤，5minX3次，抛干，加入与IgG测定相同的底物进行显色反应，用2M H2SO4终止反应。所有ELISA板均以490nm作为其OD值测定的指定波长，且各板均设置阳性和阴性对照组。參考各待测抗体对应的标准曲线(来自标准对照)进行抗体浓度的确定。9、脾细胞的培养与细胞因子的测定先将小鼠脾脏钝性分离，悬浮于预冷的Hanks平衡盐溶液HBSS，附含5%(v/v)热处理的胎牛血清FCSUOO μ g/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素。待红细胞破裂后，以T淋巴细胞为主的所有细胞被重悬于完全RPMI 1640溶液，内含10%(v/v)热处理的FCSUOmM N-2-hydroxyethylpiperazine-N,-2-etha-nesulfonic acid(HEPES)缓冲液、2mM L-谷氨酸胺、ImM 丙酮酸钠、ImM 非必氨基酸、lmg/mL 氟胞卩密唳、5 X ICT5M 2mercaptoethanoland、100U/mL青霉素、5 μ g/mL庆大霉素；随后所有脾细胞被转移至24孔细胞培养板4X IO6细胞/孔，
I.OmL/孔，在37°C、5%C02浓度条件下进行培养，用15 μ g/mL浓度的rBsc38刺激培养细胞72h后，收集细胞上清液，冻存于-80°C。对各试验组小鼠细胞因子包括白介素2、白介素4、白介素10及Y干扰素含量进行測定，并參考各自标准曲线确定各细胞因子浓度。标准曲线绘制及细胞因子检测按使用说明重复三次。10、数据分析本发明所得数据均以平均值土标准差SD的形式展示于各试验图片中。数据分析与检验使用SPSS统计软件(SPSS for Windows 13. 0) (SPSS Inc)，组间差异显著性分析使用one-way AN0VA、LSD、Duncan法或Scheffe法检验,P〈0. 05视为差异性显著。所有动物试验被重复2次,且姆个试验组包含10只小白鼠。作为判定免疫效果指标,减虫率(%) = [ (PBS组平均检获幼虫数-rBsc38-FCA-PBS组平均检获幼虫鼠)/PBS组平均检获幼虫数]X 100。ll、Bsc38基因的克隆与鉴定经PCR扩增所得Bsc38基因，最大ORF为1083bp，编码360个氨基酸；对应分子量为40. 507kDa，等电点为6. 32。切去信号肽所得成熟分子，其分子量大小为38. 478kDa，见表1，对应等电点为6. 31。NCBI同源性搜索发现，BSC380RF编码氨基酸序列与C. remaneiCRE-PYP-I 蛋白(GenBank accession no. :EFP04160)相似性为 64. 4% ;与寄生性线虫(包括马来丝虫(GenBank accession no. :EDP36300)、L. Ioa (GenBank access ionno. :EF025093)、旋毛虫(GenBank accession no. :EFV52164))和自由营生线虫(包括秀I 隐杆线虫(GenBank accession no. :ΝΡ_001023073) > C. briggsae (GenBank accessionno. :XP_002633752))的无机焦磷酸酶相似性为45. 8 56. 5%。多序列比对显示，同源区域遍布整个序列，但序列两端少见。除上述序列外，Bsc38与其他物种不具有氨基酸序列相似度。12、重组Bsc38蛋白的表达、纯化与生化特征分析Bsc38基因序列经生物信息学分析，切去信号肽，其编码成熟氨基酸序 列被亚克隆入pET32a(+)原核表达载体，然后转BL21(DE3)表达宿主菌进行融合表达，其大小约为58kDa，如图IA所示。其中，His-Tag标签蛋白为20kDa，rBsc38约为38kDa，该大小与预期蛋白分子量(Bcs38基因去信号肽编码成熟氨基酸)相符。IPTG诱导5h后，rBsc38的表达量达到最大；收集此时的表达菌进行超声处理，获取包涵体沉淀，溶于8M尿素。经过柱纯化后用尿素梯度透析进行复性。rBsc38融合蛋白的表达量为4mg每I升培养物，其纯度如图IA所示。分别以人工感染的抗西氏贝蛔虫的兔血清(试验组)、抗rBsc38小鼠免疫血清(阳性对照组)、健康兔血清(阴性对照组)作为ー杭，Western blot分析结果显示试验组和阳性对照组在58kDa处出现印迹条带，见图1B，表明rBsc38具有较好的抗原性。该纯化重组蛋白随即被运用于小鼠多克隆抗体的制备、免疫组化分析(高免血清的制备)、与不同物种免疫血清反应原性观察以及动物免疫保护试验。13、西氏贝蛔虫内源性Bsc38抗原及其同系物的鉴定分别来自西氏贝蛔虫胚胎期虫卵、L2期幼虫、L3期幼虫和成年雌虫的虫体蛋白与小鼠抗rBsc38血清印迹后，均在38kDa处呈现明显的反应条带，见图2A，而小鼠正常血清则表现为阴性，无任何印迹带，该结果证实天然的Bsc38抗原广泛分布于西氏贝蛔虫的各个发育阶段，包括胚胎期虫卵、L2期幼虫、L3期幼虫及成年雌虫。此外，来自人蛔虫(A. Iumbricoides)、猪蛔虫(A. suum)、犬弓蛔虫(T. can is)虫体蛋白提取物与抗rBsc38小鼠免疫血清作用后，在38kDa处也均出现印迹条带，见图2B，该现象表明Bsc38的同系物也存在于这三种蛔虫虫体内。小鼠阴性血清未见此反应。14、西氏贝蛔虫内源性Bsc38在雌性成体中的定位使用制备的小鼠抗rBsc38血清(试验组)及小鼠健康血清(阴性组)作为ー杭，用生物素化的山羊抗小鼠标记IgG为ニ抗，对西氏贝蛔虫雌性成虫切片进行内源性Bsc38的组织化学定位。显微镜下观察试验组西氏贝蛔虫的皮下组织、肌肉组织、肠上皮细胞、背索、侧线、非胚胎期虫卵、子宮、卵巣等组织器官呈现出明显的棕褐色，而在对照组中相应区域未见其颜色反应，见图3A-D。Bsc38的同系物蛋白在人蛔虫和猪蛔虫的免疫组化分析中，其分布区域与内源性Bsc38在西氏贝蛔虫中的相似。15、rBsc38与不同动物免疫血清的反应原性用人工感染西氏贝蛔虫的小鼠和兔血清与重组蛋白Bsc38进行印迹，结果显示rBsc38能分别与上述两种血清发生反应，出现印记条带，而两种动物阴性血清未见其反应，见图IB和图4 ;进ー步表明rBsc38具有较好的抗原性和反应原性。16、西氏贝蛔虫rBsc38抗原的疫苗免疫保护效果
通过给小鼠皮下免疫接种rBsc38-FCA_PBS(试验组)、FCAPBS (佐剂对照组)、PBS(空白对照组)，连续3次，毎次间隔2周，然后进行攻虫实验。攻虫I周后，观察记录各组小鼠体内西氏贝蛔虫移行幼虫数量。结果分析显示试验组肝脏幼虫回收数(23.6±0.81)与空白对照组(57.7±6.62)相比，明显减少(P〈0. 024)，而试验组肺脏幼虫回收数(8. 5±2. 16)较空白对照组(47. 5±5. 00)显著减少(P〈0. 0085)，整个试验组与空白对照组相比回收幼虫明显减少了(P〈0. 001) 69. 02%，见图5。此外，组织病理学观察显示试验组小鼠肝肺病变(典型的幼虫移行症状“乳斑肝”与肺出血)与对照组相比明显減少。为了进ー步说明重组Bsc38蛋白的疫苗免疫保护效果，尤其是对移行期幼虫的影响以及降低感染小鼠死亡数方面，各组剩余的10只小鼠，其存活数被进ー步观察和记录。结果显示各组小鼠在攻虫后的前8周，均未出现致死情況；而后3周里试验组(接种rBsc38-FCA-PBS)、佐剂对照组(接种FCA-PBS)、空白对照组(接种PBS)小鼠的累积死亡率分别为20%、100%、100%,与两对照组相比试验组的相对存活率为80%，见图6。攻虫后第80天，将所有存活的小鼠处死，与之前致死小鼠一起剖解，对每只小鼠的肝脏、肺脏、肾脏、脑、脾脏以及肌肉组织进行镜检，发现西氏贝蛔虫为其唯一寄生性线虫，证实各组小鼠致死病原为西氏贝蛔虫，即移行期幼虫。17、体液免疫对rBsc38-FCA-PBS 组、FCA-PBS 组、PBS 组小鼠血清抗体(IgG、IgE、IgM、IgGl、IgG2a)的ELISA检测结果显示，rBsc38-FCA-PBS组小鼠血清中IgG含量在一免后较对照组(包括=FCA-PBS组和PBS组)有显著的增加(P〈0. 001)，且在整个试验期间维持较高的水平，其峰值出现在一免后第四周和攻虫后的第一周，见图7A ;而各组小鼠血清中未检测到rBsc38特异性IgE的存在。与IgE含量类似，IgM的检测量也很低或不能检出；有趣的是在攻虫后一周，IgM的含量出现较小的升高，但各组之间彼此差异性不显著。基于试验组(rBsc38-FCA-PBS组)呈现较高的IgG反应，重组rBsc38蛋白疫苗所介导的体液免疫类型(Thl或者Th2)通过对IgG抗体亚型(IgGl和IgG2a)的测定被进ー步证实，结果表明试验组小鼠血清中IgGl和IgG2a的含量在免疫后的第2周、第4周、第6周与对照组相比均有显著上升(P〈0. 001)，但是IgGl的％含量明显高于IgG2a，见图7B。18、细胞免疫细胞因子ELISA检测显示，试验组(rBsc38_FCAPBS组)小鼠再经三次免疫接种后，其脾细胞在体外rBsc38刺激后将分泌出较对照组(包括FCA-PBS组和PBS组)小鼠脾细胞高的Th2型细胞因子白介素10 (P〈0. 001)和白介素4 (P〈0. 01)，而Thl型细 胞因子白介素2和Y干扰素在各组小鼠皮细胞培养液中的含量不存在显著性差异，如图8所示。基于细胞因子分泌情况表明重组Bsc38蛋白疫苗在小鼠免疫试验中以介导Th2型免疫反应为主。表3小鼠保护性试验设计
权利要求
1.大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原，其特征在于，其抗原基因为Bsc38基因，该基因核苷酸序列如表I所示Bsc38编码成熟肽的核苷酸序列，对应氨基酸序列如表2所示。
2.—种权利要求I所述大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原的制备方法，其特征在于，大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原按照以下步骤制备 2.I提取大熊猫西氏贝蛔虫虫体总RNA，以该RNA为模板进行反转录，合成第一条cDNA，以合成的cDNA为模板进行Bsc38基因扩增； 上游引物5’ -TAAAGATGGCATTGGCCGCATCG-3’， 下游引物5，-CACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC A-3，； 2.2对克隆质粒进行目的片段序列測定； 2.3根据Bsc38基因所测序列，除去信号肽序列，扩增编码成熟肽核苷酸序列引物 上游引物5’ -CCCAAGCTTCGACAATCTCGCAGT-3’ ,含 Hindlll 酶切位点 AAGCTT， 下游引物5’-CCGCTCGAGTCACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC-3’，含办ol 酶切位点CTCGAG ； 2.4 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶分离纯化后，与表达载体pET32a (+) —起进行沿/？ /ΙΙΙ和通ol双酶切；然后将目的片段与pET32a (+)进行连接，构建表达载体pET32a(+)-Bsc38 ;重组载体被重新转入克隆菌DH5 α进行再次克隆并测序；将测序正确的重组表达质粒转入表达宿主菌BL21 (DE3)进行IPTG诱导表达；表达温度选择37°C，诱导时间为5 h ;离心收集表达菌株，并重悬于预冷的50 mM NaH2 PO4 (pH 8. 0),10 mM Tris-HCl(pH 8. 0),100 mM NaCl裂解液中，按100 mL培养物每5 mL裂解液进行裂解；然后将裂解菌液进行超声处理并离心，收集沉淀，弃去上清；用8 M尿素冲洗所得沉淀直至完全溶解，在含有8 M尿素的变性条件下分离纯化得到重组Bsc38表达蛋白；该重组Bsc38表达蛋白即为所要制备的抗原。
3.根据权利要求2所述的大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原的制备方法，其特征在干，Bsc38基因扩增和编码成熟肽核苷酸序列扩增的PCR反应体系和反应程序为 PCR 反应体系(25μυ :2 μ cDNAU. O U Taq DNA 聚合酶、3. O mM MgCl2,400 μΜ dNTP混合液、50 μΜ IOX PCR 缓冲液(Mg2+ Free)、8μ ddH20、上下游引物各 10 pmol ； PCR反应程序94 °C预变性5 min;94°C变性30 sec，62°C退火30 sec，72°C延伸45sec，循环扩增35次，最后72°延伸10 min ;扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离，纯化；然后纯化产物被连接入PMD19-T载体，转感受态细胞DH5 α进行亚克隆。
4.根据权利要求I所述的大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原的应用，其特征在干，将重组Bsc38蛋白用O. 01 M, pH 7. 4的稀释液PBS稀释，然后与弗氏完全佐剂FCA进行等体积混合制成针剂，混合液4°C避光处理16 h，以备使用。
全文摘要
一种大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原以及制备该抗原的方法和应用，该抗原基因为Bsc38基因，该基因核苷酸序列如表1所示Bsc38编码成熟肽的核苷酸序列，对应氨基酸序列如表2所示。本发明针对目前大熊猫西氏贝蛔虫病的防治仍以药物防治为主，药物的频繁使用导致耐药性虫株的出现以及化学药物所产生的食物链和环境污染等问题，鉴定和筛选出了一个用于制备预防大熊猫西氏贝蛔虫病的基因工程疫苗侯选抗原。与现有技术相比，本发明能减少大熊猫西贝氏蛔虫病药物防治过程中耐药虫株的出现和药物对食物链和环境的污染，能减轻自然环境下大熊猫的重复性感染。本发明在国内外首次阐明了西氏贝蛔虫幼虫感染宿主后的分子免疫机制。
文档编号C07K14/435GK102675446SQ20121017140
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年3月8日
发明者严玉宝, 余华, 古小彬, 彭雪蓉, 杨光友, 王淑贤, 谢跃, 陈世界 申请人:四川农业大学