专利名称：保护性抗原Omp25c在布鲁氏菌疫苗制备中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白的新用途，特别是涉及布鲁氏菌疫苗株M5的重要免疫保护性抗 原0mp25c蛋白在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。
背景技术：
布鲁氏菌病(brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一类 动物源性疾病，是一种重要的人畜共患病，在世界范围内广泛流行。布鲁氏菌可感染人 类、多种家畜和野生动物，病人主要症状为慢性关节炎及神经损伤，病畜主要表现为流产 和不育(尚德秋.布氏菌病研究进展.中国地方病防治杂志2004，19 =204-212 ；Corbel, Μ. J. Brucellosis :an overview. Emerg Infect Dis 1997，3 :213-21.)。布病不仅给我国畜 牧业生产造成巨大的经济损失，也严重威胁人民的健康生活。另外，布鲁氏菌还被用作生物 武器，对国家安全存在着严重的威胁。近年来布病的发病率呈上升趋势，我国布病的发病率 已经超过历史最高水平，引起相关部门的高度重视。布鲁氏菌的外膜蛋白最早于20世纪80年代早期被发现，外膜蛋白在稳定细菌 外膜的结构、适应胞内外环境和抵抗胞内杀菌机制等方面起着重要作用，与布鲁氏菌的 毒力密切相关，同时也是免疫原性蛋白的重要来源(Schurig G G，Sriranganathan N， Corbel M J.Brucellosis vaccines :past,present and future. Vet Microbiol 2002,90 479-496.)。因此，很多有关布鲁氏菌致病机制和免疫反应机制的研究都集中在外膜蛋白 的研究上。Jos印h P. Connolly等在进行牛布鲁氏菌的免疫蛋白质组研究时，发现0mp25c 是牛布鲁氏菌的免疫原性蛋白(Connolly，J. P. et al. Proteomicanalysis of Brucella abortus cell envelope and identification of immunogeniccandidate proteins for vaccine development. Proteomics 2006.6:3767-80.)。但并非所有的免疫原性蛋白都具 有免疫保护性，如0!11 31，8 沈等免疫原性蛋白就没有免疫保护性。发明人在前期的羊布鲁 氏菌外膜蛋白质组研究中也发现，0mp25c蛋白是羊布鲁氏菌外膜蛋白的主要成员，但是该 蛋白在羊布鲁氏菌毒力和免疫保护性方面是否起着重要作用仍不清楚，发明人通过在疫苗 株中缺失omp25c并分析其毒力和免疫保护性的改变，来探讨omp25c蛋白在布鲁氏菌疫苗 中的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供0mp25c蛋白的一种新的医药用途。发明人的研究表明，0mp25c蛋白在布鲁氏菌疫苗的保护性中起着重要作用，具有 增强布鲁氏菌免疫保护性的作用，可以在制备布鲁氏菌疫苗中得到广泛应用。本发明所提供的布鲁氏菌疫苗的活性成份为上述可激发机体对布鲁氏菌产生免 疫力的保护性抗原0mp25c蛋白。免疫原性蛋白0mp25c在制备布鲁氏菌抗体的免疫保护性蛋白中的应用也属于本 发明的包括范围。
本发明提供的免疫保护性抗原，可以在布鲁氏菌疫苗株高表达，从而进一步提高 疫苗的免疫保护效果。本发明提供一种0mp25c蛋白的新用途，即在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。为分析 0mp25c对布鲁氏菌疫苗株M5的毒力及免疫保护性的影响，本发明首先表达了 0mp25c蛋白， 确认它们的免疫原性，然后构建M5的omp25c基因缺失突变株，比较缺失突变株和疫苗株的 毒力和免疫保护性，对0mp25c蛋白的免疫保护性进行分析。与M5比较，omp25c突变株在小 鼠脾脏内的存活时间较短，在第4周时未能被检出。抗体水平检测结果表明，omp25c突变株 和M5疫苗株在Balb/c小鼠体内均能诱导产生特异性抗体，但是与M5相比，突变株引起的 体液免疫应答相对较弱，持续时间较短。而且突变株诱导产生反映体液免疫应答的细胞因 子IL-10的水平也远比M5低。突变株和M5疫苗株的小鼠脾淋巴细胞均能分泌IFN- γ，但 是突变株IFN-Y浓度明显低于疫苗株。免疫应答结果表明，突变株的体液和细胞免疫应答 能力明显下降，免疫原性减弱。攻毒实验结果表明，接种了 omp25c突变株的小鼠用16M攻 毒后，免疫保护效果下降，与M5疫苗株存在显著的差距。实验结果表明，与疫苗株M5相比， omp25c突变株毒力减弱，说明omp25c基因在M5疫苗株的毒力中发挥一定的作用。omp25c 的缺失使得M5诱导的体液和细胞免疫水平及免疫保护效果下降，说明omp25c对疫苗株M5 的免疫应答和免疫保护效果有一定的影响。由此可见，外膜蛋白0mp25c在布鲁氏菌疫苗株 M5的毒力和免疫保护性方面发挥重要的作用，是布鲁氏菌疫苗的关键成份，可以其为活性 成份制备布鲁氏菌疫苗。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为重组蛋白0mp25c的SDS-PAGE检测结果图2为重组蛋白0mp25c的免疫原性分析结果图3为含突变盒N-K-C的重组质粒pUC19K-NC的1 %琼脂糖凝胶电泳检测结果图4为omp25c缺失突变株的PCR鉴定结果图5为omp25c缺失突变株在小鼠脾脏内的存活能力检测结果图6为小鼠血清总IgG水平检测结果图7为IFN-Y检测结果图8为IL-10检测结果图9为免疫保护实验结果
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。本发明中，0mp25c表示蛋白， 斜体小写omp25c表示基因。
实施例1、0mp25c蛋白的表达及免疫原性分析一、0mp25c蛋白的表达1、表达引物的设计B. melitensis 16M已完成全基因组测序，根据GenBank中收录的16M序列及注释 信息(GenBank号AE008918)，用SignalP软件分析基因的信号肽序列并去除相应的信号肽序列，DNAMar软件分析蛋白的抗原性及疏水性后，用I^rimer Premier 5 (PREMIERBiosoft International,Palo Alto)设计 0mp25c 蛋白的特异性表达引物BMEI18^-E_F :3，-ACGT GGATCCGACGCCGTCATTGAACAGG-5’ 和 BMEI1829-E-R 3’ -AGCTAAGCTTGAACTTGTAAGCGACACCG-5 ’。再根据表达载体PET3M的多克隆酶切位点信息在上游引物的5’端添加BamH I酶切位 点，在下游引物的5’端添加Hind III酶切位点。2、重组表达载体的构建以16M基因组为模板，使用上述引物BMEI18^-E-F和BMEI1829-E-R用PCR的 方法扩增omp25c基因。PCR反应体系为10XPCR缓冲液5μ 1，dNTP (2. 5mM) 4 μ 1，上游 引物(20 μ Μ) 0. 5 μ 1，下游引物(20 μ Μ) 0. 5ul，rTaq 酶(5U/y 1)0. 25 μ 1，模板 DNA(10ng/ μ 1)1 μ 1，加水补齐至终体积 50μ 1。PCR 反应条件为94°C 5min ；95°C 30s,56°C 30s， 72°C 60s，共30个循环；72°C IOmin0反应结束后，回收PCR扩增产物，对其用BamHI和 HindIII进行双酶切消化，并与经同样酶切消化处理的pET3h载体(购自Takara公司)相 连，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞行复制，涂于含0. lmg/mL氨苄青霉素的LB 培养基平板上，37°C培养过夜。长出的单克隆经PCR及酶切鉴定正确后，送测序公司进行测 序，结果得到序列及插入位置均正确的重组表达载体，命名为pET3h-25c。3、重组蛋白的诱导表达将测序正确的重组表达载体pET3h-25c转化大肠杆菌ER2566中，用含0. Img/ mL氨苄青霉素的抗性LB琼脂平板筛选阳性克隆。将PCR鉴定呈阳性的表达克隆接种至含 0. lmg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，用0. 5mmol/L的IPTG诱导，同时设阴性对照，用 12% SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。阳性菌株进行大量诱导，超声裂解破碎后，分别收集 上清和沉淀，进行SDS-PAGE，对融合蛋白进行可溶性分析。SDS-PAGE检测结果如图1所示 (M =Protein Ruler III ；1 阴性对照；2 :0mp25c(42. 44kD)), omp25c 能在大肠杆菌 ER2566 中表达出与预期大小相符的蛋白44kD)。重组蛋白的阳性菌株大量诱导后，离心收集菌 体，用PBS悬浮，超声裂解破碎，分别收集上清和沉淀，进行纯化。二、重组蛋白0mp25c的免疫原性分析用western blotting分析重组蛋白0mp25c的免疫原性。方法为将蛋白表达产 物经12% SDS-PAGE电泳后，通过湿转法转膜至硝酸纤维素膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封 闭过夜，用TBST漂洗后，用纯化的兔抗布氏杆菌抗体为一抗，同时设正常兔血清作为对照， 室温孵育Ih后，漂洗，加入1 1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(军事医学 科学院微生物流行病研究所)，室温孵育lh，漂洗后将膜浸入DAB底物溶液中，至目的条带 清晰时终止反应。结果如图2所示(M =Protein Ruler III ；1 :0mp25c)，0mp25c蛋白能与 羊布鲁氏菌血清结合，具有免疫原性。实施例2、omp25c突变株的构建一、引物设计根据0mp25c基因(BMEI1829)的ORF及两侧的序列，设计扩增N端和C端同源臂的 引物，N端同源臂扩增引物为BMEI1829-N-F和BMEI1829-N-R，5’端酶切位点分别为KpnI 和Xho I ；C端同源臂扩增引物为=BMEI 1829-C-F和BMEI1829-C-R，5，端酶切位点分别为 Sal I和Hind III。此外，分别在卡那基因的内部及靶标基因同源臂的外侧设计突变株鉴 定引物(Pucl9K-F和BMEI1829-I-R)，用于确定omp25c基因的正确替换。设计的引物及其序列见表1。 表1引物序列引物sequence (5'-3')Pucl9K-FACGTGGATCCCTCGAGGGGCCCGCCACCTGGGATGAATGTCBMEI1829-N-FACGTGGTACCGTTTCAAGTTCCTGCCCACGBMEI1829-N-RACGTCTCGAGGCCGAGATAGGCACCATTCCBMEIl 829-C-FACGTGTCGACGACGACGCTGCCGTTACCABMEI1829-C-RACGTAAGCTTCCTGACCGCCGAAATAAGCBMEIl 829-I-RGTTGTAGCCGGTGTAAAGG二、omp25c突变盒及突变载体的构建以16M基因组为模板，首先扩增omp25c基因的N端同源臂，先将扩增的同源臂N 端片段插入到pUC19K(乔凤，陈泽良，王玉飞，等.pUC19K质粒的构建及其在布鲁氏菌缺失 标记株构建中的应用.中国生物工程杂志2007，27 :1-5.)的Kpn I和BioI位点，得到质粒 PUC19K-N ；然后扩增C端同源臂，将C端片段插入到pUC19K-N的Ml I和Hind III位点，得 到含有突变盒N-K-C的突变载体pUC19K-NC。为进一步确认N、C端同源臂的正确插入，分别 用Kpn I和Hind III双酶切对突变载体pUC19K_NC进行鉴定，切出突变盒N-K-C片段，1 % 琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示(1 :pUC19K-NC/KpnI+HindIII ；2 :pUC19K_NC质粒；M MarkerIII)，与预期大小一致。将鉴定正确的质粒pUC19K_NC转化大肠杆菌DH5 α感受态 细胞进行复制，涂于含0. lmg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上，37°C培养过夜。将长出的 单克隆经PCR和酶切鉴定正确之后，送测序公司测序，结果得到序列及插入位置均正确的 重组表达载体PUC19K-NC。三、omp25c缺失突变体的筛选与鉴定将含突变盒的载体pUC19K-NC质粒DNA电转化入布鲁氏菌M5电感受态细胞中，复 苏后涂布含有50 μ g/mL卡那霉素的大豆胰蛋白胨琼脂TSA平板(生物梅里埃公司)，37°C 培养3-5天，筛选AmpsKanlr抗性克隆。用突变株的鉴定引物(BMEI1^9_I_R与Pucl9K_F，序 列见表1)对抗性克隆进行菌落PCR鉴定，结果如图4所示(M :marker III ；1 :Μ5 Δ omp25c ； 2. M5)，挑取的克隆用鉴定引物可扩增出预期大小的产物(1.68Kb)，而野生株扩增为阴性， 初步表明缺失突变株构建是正确的。对能扩增出预期大小的片段的产物的抗性克隆进行测 序确认，结果得到omp25c基因突变体重组菌株，命名为M5A0mp25c。实施例3、动物实验一、实验动物及动物免疫选用6 8周龄Balb/c小鼠(军事医学科学院动物中心)，随机分为4组，每组 30只。第1组为M5减毒活菌苗(中国药品生物制品检定所)；第2组为突变株M5 Δ omp25c 免疫组，免疫剂量2 X IO5CFU/只；第3组为生理盐水对照组，免疫剂量200 μ L/只。采取腹 膜腔注射，免疫次数为1次。二、0mp25c缺失突变株在小鼠脾脏内的存活能力检测分别用疫苗株M5和omp25c缺失突变株M5 Δ omp25c免疫小鼠，于免疫后的第7、14 和28天无菌取出小鼠的脾脏，每个时间点每组选取5只小鼠，眼球取血后处死小鼠，迅速取 出脾脏，加入ImL含有0. 1% Triton X-100的生理盐水，用玻璃勻浆器制成勻浆，取组织勻浆进行10倍系列稀释，选取适当稀释度的勻浆液100 μ L涂TSA平板，计算CFU。结果如图 5所示，在各时间点，M5A0mp25c实验组脾脏中缺失突变株的数量均少于M5阳性组。第28 天时，M5的细菌数的log值为1. 2，而突变株未能被检出。该实验表明omp25c缺失后，布鲁 氏菌M5的胞内细菌数减少，毒力减弱。三、小鼠血清总IgG水平检测分别于免疫后第7、14、观、42、56天检测小鼠血清抗体，方法为于小鼠尾部采血， 4°C过夜，4000rpm离心lOmin，分离血清待用。采用间接非竞争ELISA方法检测血清抗体水 平。具体操作是用108CFU/mL M5灭活菌以每孔100 μ L包被酶联板，将待测血清按1 400 稀释，每孔100 μ L，加羊抗鼠IgG-HRP反应，最后加底物TMB显色，置于酶标仪测450nm吸 光度(OD)值。结果如图6所示，M5组在第14天就可以明显检测到抗体，第观天抗体滴 度达到最高(OD45tl = 0. 84 ，第42、56天抗体水平虽略有下降，但是仍然维持在较高水平。 M5 Δ omp25c实验组虽然在第14天能检测到抗体，但是不如M5阳性组显著，抗体滴度在第 28天达到最高(OD45tl = 0. 435)，到第42天时开始下降。虽然M5 Δ omp25c的抗体滴度变化 趋势与M5类似，但是其各个时间点的抗体水平均明显低于M5减毒活疫苗组(P < 0. 05)。四、细胞因子检测1、小鼠脾细胞的分离在免疫后的不同时间点，从每个实验组中各取3只小鼠处死并无菌取脾，以200目 铜网分离出单细胞，将脾细胞加入离心管中lOOOrpm/min离心15min后弃上清。以低渗红 细胞裂解液室温避光裂解红细胞15min，离心弃上清。再以30mL含2%小牛血清的1640培 养基将细胞洗2次，以含10%小牛血清的1640完全培养基重悬细胞，计数，最终将细胞浓度 稀释为5X106/mL。2、体外刺激将免疫和对照小鼠脾细胞分别取100 μ L加入细胞培养板(5X IO5细胞/孔)，不同 菌株取100 μ L加入相应的孔，每孔IO8CFU,每种菌株重复3孔。分别以100 μ L的ConA (浓 度为5μ g/mL，Sigma公司)和1640完全培养基为阳性和阴性对照。混合物培养在37°C、 饱和湿度和5% CO2的培养箱内，72h后取上清检测IFN-Y和ILlO。测IFN-y/ILlO的试 剂盒采用R & D System公司的Mouse IFN- y /IL-10 Immunoassay Kit，将稀释好的细胞上 清样品加入到酶联板孔中，用双抗夹心方法，反应后测其OD45tl值。3、IFN-γ 检测布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，细胞免疫的意义大于体液免疫。因此本发明检测 了在M5和M5A0mp25c免疫过程中小鼠血清细胞因子IFN-γ的水平，结果如图7所示。 与PBS对照组相比，Μ5菌株在免疫后7天即激发了一定程度的细胞免疫，随后IFN-Y水 平持续上升，并且在监测的42天达到了最高值，在免疫后第56天，浓度还维持在较高水 平。M5Aomp25c组在14天时诱导了一定水平的IFN-γ，观天时达到最高峰，但在42天时 IFN-Y水平已经开始下降。实验结果表明，omp25c缺失以后，布鲁氏菌诱导产生IFN-Y的 水平明显降低。说明0mp25c蛋白在布鲁氏菌M5的细胞免疫中发挥了重要的作用。4、IL-10 检测据文献报道，IL-10主要是在布鲁氏菌的体液免疫中发挥一定的作用。因此本发 明检测了在M5和M5 Δ omp25c免疫过程中小鼠血清细胞因子IL-10的水平，结果如图8所示。与PBS对照组相比，M5及M5 Δ omp25c均能诱导一定水平的IL-10，而且变化趋势大致 接近。在免疫后42天时达到最高峰，而后下降。但整体来说，M5A0mp25c组IL-10的水平 低于M5组。结合小鼠血清总IgG水平检测，说明0mp25c蛋白在布鲁氏菌M5的体液免疫中 也发挥了重要的作用。五、免疫保护实验于小鼠免疫后第8周进行攻毒实验，腹膜腔内注射强毒株16M(中国药品生物制品 检定所)，IO5Cfu/只。攻毒后第1、2、4周处死小鼠，无菌取脾脏，研磨，稀释后接种于TSA平 板，培养3 4天，菌落计数，IogltlCFU士SD的平均值即为每组的攻毒结果。结果如图9所 示，用布鲁氏菌16M强毒株攻毒后，与PBS组比较，M5A0mp25c没有产生明显的保护力，而 且较M5减毒活疫苗的免疫保护效果差异显著(P < 0. 05)。结果表明，omp25c缺失突变株 的免疫保护效果明显下降，再次说明0mp25c蛋白对布鲁氏菌M5具有一定的免疫保护性。布鲁氏菌是一种胞内寄生的细小的球状杆菌，在胞内有极强的生存能力，使得布 鲁氏菌引起的感染一旦发生，很难彻底治愈。外膜蛋白与布鲁氏菌的毒力密切相关，同时也 是免疫原性蛋白的重要来源。但是尚没有人研究0mp25c蛋白在毒株及疫苗株的毒力和免 疫保护性中发挥的作用。在上述实施例中，我们挑选了我国最常用的羊布鲁氏菌减毒活疫 苗株M5作为靶标，对M5进行基因突变改造，构建了布鲁氏菌外膜蛋白omp25c基因的缺失 突变株。探讨了缺失突变株的毒力、免疫原性及保护性，从而分析0mp25c蛋白在疫苗株M5 毒力和免疫保护性中发挥何等作用。在上述实施例中，我们首先表达了 0mp25c蛋白，分析了它们的抗原性。结果表明 0mp25c蛋白可以和羊布鲁氏菌血清结合，具有免疫原性。接着，我们进一步分析了 0mp25c 蛋白对M5疫苗株的毒力和免疫保护性的影响。动物实验结果表明，0mp25c蛋白与布鲁氏菌 的毒力相关，缺失该基因的缺失突变株对小鼠的毒力明显减弱，不能在小鼠体内长期存活。 抗体水平检测结果表明，omp25c突变株和疫苗株M5在Balb/c小鼠体内均能诱导产生特异 性抗体，但是与M5相比，突变株引起的体液免疫应答相对较弱，持续时间较短。而且突变株 诱导产生反映体液免疫应答的细胞因子IL-10的水平也远比M5低。布鲁氏菌感染宿主后寄 生于巨噬细胞内，因此引起的机体免疫应以细胞免疫为主。即布鲁氏菌激发抗原递呈细胞， 弓 1 Th Thl (Mosmann T R, Sad S. The expanding universe of T-cell subset :Thl, Th2 and more. Immunol Today, 1996,17 :138-146), Thl 细胞分泌 IFN-γ 从 而上调巨噬细胞的吞噬作用，同时还能直接杀灭布鲁氏菌感染的巨噬细胞达到保护宿主的 巨的(Murphy A, Sathiyaseelan J, Parent MA, et al. Interferon-gamma is crucial for survivinga Brucella abortus infection in both resistant C57B/6 and susceptible Balb/cmice. Immunology 2003,19 :218-220)。因此，有效的布鲁氏菌疫苗必须能诱导以产 生IFN- γ为特征的Thl型免疫反应。突变株和疫苗株M5免疫小鼠后，小鼠脾淋巴细胞均能 分泌IFN-Y，但是突变株IFN-γ浓度明显低于疫苗株。免疫应答结果表明，突变株的体液 和细胞免疫应答能力明显下降，免疫原性减弱，说明0mp25c在M5疫苗的体液免疫及细胞免 疫过程中都发挥了重要的作用，能够增强疫苗的细胞和体液免疫。另外，从攻毒结果来看， 缺失了 omp25c的突变株丧失了良好的保护性，与疫苗株M5存在显著的差距，显示omp25c 对减毒活疫苗株M5的免疫保护效果有一定的影响。由此可见，外膜蛋白0mp25c在布鲁氏 菌疫苗株M5的毒力和免疫保护性方面发挥重要的作用，能够增强疫苗的免疫保护作用，可以其为活性成份制备布鲁氏菌疫苗。利用外膜蛋白0mp25c进行布鲁氏菌疫苗的制备可采 用现有常规方法，本文不予赘述。
权利要求
1.0mp25c蛋白在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于为免疫原性蛋白0mp25c在制备布鲁氏菌 抗体的免疫保护性蛋白中的应用。
全文摘要
本发明公开了布鲁氏菌的一种保护性抗原Omp25c蛋白及其在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。实验结果表明，与野生型疫苗株相比，omp25c突变株毒力减弱，说明omp25c基因在疫苗株的毒力中发挥一定的作用。omp25c缺失株诱导的体液和细胞免疫水平及免疫保护效果均下降，说明omp25c对疫苗株的免疫应答和免疫保护效果有促进作用。由此可见，Omp25c蛋白是布鲁氏菌的一个重要保护性抗原，能够增强疫苗株诱导的免疫反应及其保护效果，以其为活性成份制备布鲁氏菌疫苗，可提高疫苗的免疫保护效果。
文档编号A61K39/10GK102038941SQ20091023649
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月23日 优先权日2009年10月23日
发明者孙岩松, 徐杰, 曲勍, 杜昕颖, 汪舟佳, 王玉飞, 钟志军, 陈泽良, 黄留玉 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所