布鲁氏杆菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种布鲁氏杆菌快速检测试剂盒及其检测方法。试剂盒中含有SEQIDNO：1-SEQIDNO：4组成的特异性引物和1个特异性探针SEQIDNO：5。所述技术可用于布鲁氏杆菌的检测。其特征是：该技术将环介导等温扩增技术与横向流胶体金试纸条检测技术相结合，能够肉眼直观的判定检测结果。该技术具有准确、快速、方便、高效、特异、灵敏的特点，适用于进出口检疫、食品卫生检验等的现场检测，对于保障食品安全具有重要意义。
【专利说明】布鲁氏杆菌LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物卫生和食品检验【技术领域】，涉及一种用于检测布鲁氏杆菌菌株的 LAMP-LFD试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌病(简称布病，Brucellosis，又称地中海弛张热、马耳他热、波浪热或波 状热）是由布鲁氏菌（Brucella)引起的一种变态反应性人畜共患传染病，严重地威胁着多 种动物和人的健康，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生危害。我国农业部将其列为二 类动物疫病，卫生部将其列为乙类传染病，世界动物卫生组织（OIE)将其列为法定报告动物 疫病。其在自然环境中生活力较强，在病畜的分泌物，排泻物及死畜的脏器中能生存4个月 左右，在食品中约生存2个月。羊、牛、猪是其主要宿主，羊、牛、猪和其畜产品与人类接触密 切，从而增加了人类感染的机会，因此建立快速、准确的检测方法是保证人类和动物生命安 全的重要手段。
[0003] 传统的布鲁氏杆菌诊断主要通过病原分离与生化鉴定完成，但其存在细菌培养操 作繁琐、耗时长，不易鉴别相近物种或亚型等缺点。随着分子生物学检测技术的发展，以 omp25基因、omp31基因、BM28基因等为靶标建立的PCR或实时定量荧光PCR技术已成功应 用于布鲁氏杆菌的实验室诊断，具有特异性强、灵敏度高和速度快等优点，但该方法必须配 备昂贵的仪器设备，需专门的操作人员，在适应性上有一定的缺陷。环介导等温扩增技术是 Notomi等于2000年建立的，该技术通过针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，利 用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)在等温65°C左右，几十分钟，即可实现核 酸的高效扩增。该方法仅需要简单的水浴锅或加热器，操作简便、特异性强、灵敏度高、检测 快速，适合于基层及现场使用。
[0004] 2008年Kiatpathomchai首次将横向流动试纸条技术与环介导等温扩增技术相结 合（LAMP-LFD)，用于 LAMP 扩增产物的检测（Kiatpathomchai et al·，2008)。目前，该方 法已被成功用于嗜盐弧菌、人的非洲锥虫病、副溶血霍乱弧菌、桃拉病毒、传染性肌肉坏死 病毒、对虾白斑症病毒等病原的检测。在横向流动试纸条技术检测反应中FITC标记的探针 与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，并与胶体金标记的抗FITC的抗体结合形成三 元复合物，并结合在横向流动试纸条具有生物素抗体的检测线上；未杂交的FITC标记探针 与胶体金标记的抗FITC的抗体形成不含生物素的两元复合物，通过检测线，结合在控制线 上。这样可以通过检测带是否显色判断扩增产物的有无。该检测方法依赖于序列之间的 特异性扩增，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳 性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。并且不需要电泳装置和凝胶成像系统，无需EB 等有毒试剂，检测时间短，结果可肉眼观察。因此，LAMP-LFD方法安全、快速、高效且无设备 及技术限制，具有其他技术无法替代的优势。
[0005] 本专利将环介导等温扩增技术（LAMP))与横向流动试纸条技术（LFD)相结合，针 对布鲁氏杆菌重要的毒力因子〇聊激基因设计一套引物和探针，优化反应条件，建立布鲁 氏杆菌LAMP-LFD检测技术。本试剂盒操作简便，作为布鲁氏杆菌的初筛工具，尤其适用于 基层检验检疫机构，为布鲁氏杆菌的疫情监控和快速检测提供了新的发展方向。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供了一种用于检测布鲁氏杆菌的LAMP特异性引物组和1 个特异性探针，它包括： BRU-F3 GACGGCCTGGAAGTCAAG SEQ ID NO ： 1 BRU-B3 GGGTGTAACGGTACTCAACG SEQ ID NO ：2 BRU-FIP GAGGTACGGCATAACCGGGTTCTTTTCGGAATTCCGGCTTTGMGGCTCGCTCG SEQ ID NO ： 3 BRU-BIP AACAACGGCTTGGACGACGATTTTTGTCCGTCAGCTTGGCTT SEQ ID NO ：4 BRU-HP ACCCAGTACGGCAACAAGAAC SEQ ID NO ：5 其中BRU-FIP引物和BRU-HP探针分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素。
[0007] 本发明进一步公开了采用用于检测布鲁氏杆菌LAMP-LFD特异性引物组制成的检 测试剂盒，其特征在于它的组成如下： (1) LAMP反应液： LAMP 反应液中含有：2XBuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L ;BRU-F3 0. 5 μ L ；BRU -B3 0· 5 μ L ;BRU -FIP 0· 5 μ L ;BRU -BIP 0· 5 μ L ; dNTPs 3· 5 μ L (2) 超纯水 (3) Bst 酶（8υ/μ L) (4) 8冊-即探针2(^111〇1 (5) 横向流动试纸条 (6) 用于检测布鲁氏杆菌的LAMP特异性引物和1个特异性探针；其中的引物和探针指 的是： BRU-F3 GACGGCCTGGAAGTCAAG SEQ ID NO ： 1 BRU-B3 GGGTGTAACGGTACTCAACG SEQ ID NO ：2 BRU-FIP GAGGTACGGCATAACCGGGTTCTTTTCGGAATTCCGGCTTTGAAGGCTCGCTCG SEQ ID NO ： 3 BRU-BIP AACAACGGCTTGGACGACGATTTTTGTCCGTCAGCTTGGCTT SEQ ID NO ：4 BRU-HP ACCCAGTACGGCAACAAGAAC SEQ ID NO ：5 其中BRU-FIP引物和BRU-HP探针分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素。
[0008] 本发明更进一步公开了采用此试剂盒，用于检测食源性布鲁氏杆菌的LAMP-LFD 方法，其特征在于，按如下的步骤进行： (1) LAMP 扩增反应体系为：2XBuffer (含 Mg2+) 2.5yL;BRU-F3 0. 5 μ L ；BRU -B3 0· 5 μ L ;BRU-FIP 0· 5 μ L ;BRU-BIP 0· 5 μ L ; dNTPs 3· 5 μ L ;8U/ μ L Bst 酶 1 μ L ;力口入样 品DNA模板1至5 μ L ;用超纯水补充至终体积25 μ L (2) 扩增反应过程：63 °C进行60min。
[0009] (3)扩增反应结束后不经过终止反应，而在反应体系中加入20pmol的探针 BRU-HP，63°C杂交5min。杂交结束后，从反应液中取8μ?杂交液加入到10〇μ? Buffer中混 匀，将LFD试纸条浸入其中，反应约5分钟读取检测结果。
[0010] (4)结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现紫红色条带，检测结果为阳性，则 说明样品中含有布鲁氏杆菌；试纸条只有质控线出现紫红色条带，检测结果为阴性；如只 有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。
[0011] 本发明同时也公开了用于检测布鲁氏杆菌的LAMP特异性引物组在制备用于检测 布鲁氏杆菌LAMP-LFD试剂盒中的应用。
[0012] 实验结果表明：采用本发明所公开的布鲁氏杆菌的LAMP特异性引物组制备的试 剂盒在检测布鲁氏杆菌LAMP-LFD方面具有良好的积极效果。
[0013] 本发明公开的用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒与现有技术相比所具有的积极效果 在于： (1)本发明采用的LAMP技术具有操作简便、快速、敏感等特点，其敏感性可达到1至 l〇pg，比常规PCR高10倍以上；而且检测过程只需恒温水浴锅即可完成，不需要PCR仪等昂 贵的设备，更适合于基层推广应用。此外，本发明将LAMP技术与横向流动试纸条技术相结 合，可以通过肉眼直接观察和判定结果，仅需5-10min，比PCR方法(琼脂糖凝胶电泳）缩短 15-20min，且避免了电泳染料对环境的污染，使检测更为便捷、环保。
[0014] (2)基于LAMP-LFD方法的敏感、特异，成本低廉，便于操作等诸多优势，本发明在 一定程度上提高了我国布鲁氏杆菌菌株的检测能力，为布鲁氏杆菌疾病的临床实时快速诊 断、动物和食品的出入境检验检疫中该菌的快速准确检测提供了新技术来源，对提高我国 检验检疫机构布鲁氏杆菌的疫情监控和快速检测水平，以及普及先进技术在基层检验检疫 机构的推广应用均具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为LAMP-LFD试验图；自左向右，依次为1 :布鲁氏杆菌；2 :空白对照； 图2为食品样品的布鲁氏杆菌LAMP-LFD试验图；自左向右，依次为1-7 :10°、10'10_2、 10_3、10_4、10_5、10_6 稀释；8 :阴性对照； 图3为LAMP-LFD特异性试验图；自左向右，依次为1 :羊种布鲁氏杆菌；2 :胎儿弯曲杆 囷；3:大肠杆囷；4:沙门氏囷；5 :犬种布鲁氏杆囷；6 :金黄色甸甸球囷；7 :猪种布鲁氏杆 菌；8:牛种布鲁氏杆菌；9:阴性对照。
【具体实施方式】
[0016] 为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测布鲁氏杆菌的LAMP-LFD 引物组和1个探针的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其 中所用的试剂原料均有市售。本发明所述的布鲁氏杆菌引物组和探针序列见表1。
[0017] 表 1
【权利要求】
1. 一种用于检测布鲁氏杆菌的LAMP特异性引物组，其特征在于它是由下述引物组成： BRU-F3 GACGGCCTGGAAGTCAAG SEQ ID NO ： 1 BRU-B3 GGGTGTAACGGTACTCAACG SEQ ID NO ：2 BRU-FIP GAGGTACGGCATAACCGGGTTCTTTTCGGAATTCCGGCTTTGAAGGCTCGCTCG SEQ ID NO ：3 BRU-BIP AACAACGGCTTGGACGACGATTTTTGTCCGTCAGCTTGGCTT SEQ ID NO ：4 其中BRU-FIP的5'端标记生物素。
2. -种用于检测布鲁氏杆菌的LAMP扩增产物的特异性探针，其特征在于它是由下述 基因组成：BRU-HP ACCCAGTACGGCAACAAGAAC SEQ ID NO ：5 所述BRU-HP的5'端标记有异硫氰酸荧光素。
3. -种含有权利要求1、2所述用于检测布鲁氏杆菌LAMP-LFD特异性引物组和1个特 异性探针的检测试剂盒，其特征在于它的组成如下： (1) LAMP反应液： LAMP 反应液中含有：2XBuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L ;BRU-F3 0. 5 μ L ； BRU-B3 0· 5 μ L ;BRU-FIP 0· 5 μ L ;BRU-BIP 0· 5 μ L ; dNTPs 3· 5 μ L 超纯水 Bst 酶（8U/y L) (4) 8冊-即探针2(^111〇1 (5) 横向流动试纸条 (6) 用于检测布鲁氏杆菌的LAMP特异性引物和1个特异性探针；其中的引物和探针指 的是： BRU-F3 GACGGCCTGGAAGTCAAG SEQ ID NO ： 1 BRU-B3 GGGTGTAACGGTACTCAACG SEQ ID NO ：2 BRU-FIP GAGGTACGGCATAACCGGGTTCTTTTCGGAATTCCGGCTTTGAAGGCTCGCTCG SEQ ID NO ：3 BRU-BIP AACAACGGCTTGGACGACGATTTTTGTCCGTCAGCTTGGCTT SEQ ID NO ：4 BRU-HP ACCCAGTACGGCAACAAGAAC SEQ ID NO ：5 所述的BRU-FIP引物和BRU-HP探针分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素。
4. 一种采用权利要求2所述试剂盒，用于检测食源性布鲁氏杆菌的LAMP-LFD方法，其 特征在于，按如下的步骤进行： (1) LAMP 扩增反应体系为：2XBuffer (含 Mg2+) 2.5yL;BRU-F3 0. 5 μ L ； BRU-B3 0· 5 μ L ;BRU-FIP 0· 5 μ L ;BRU-BIP 0· 5 μ L ; dNTPs 3· 5 μ L ;8U/ μ L Bst 酶 1 μ L ;力口入样 品DNA模板1至5 μ L ;用超纯水补充至终体积25 μ L (2) 扩增反应过程：63 °C进行60min; (3) 扩增反应结束后不经过终止反应，而在反应体系中加入20pmol的探针BRU-HP， 63°C杂交 5min ; 杂交结束后，从反应液中取8μ?杂交液加入到10〇μ? Buffer中混匀，将LFD试纸条浸 入其中，反应约5分钟读取检测结果； (4)结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现紫红色条带，检测结果为阳性，则说明 样品中含有布鲁氏杆菌；试纸条只有质控线出现紫红色条带，检测结果为阴性；如只有检 测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。
5.权利要求1、2所述用于检测布鲁氏杆菌的LAMP特异性引物组和1个特异性探针在 制备用于检测布鲁氏杆菌LAMP-LFD试剂盒中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104263839SQ201410537398
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月13日 优先权日:2014年10月13日
【发明者】李秀梅, 郭恋, 李颖, 梁智选, 石瑜, 朱雅宁, 袁雪涛, 张立新, 王健春, 杨爱华, 尹春博, 王虹, 赵静 申请人:天津市动物疫病预防控制中心