专利名称：布鲁氏菌抗体快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，涉及布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因工 程抗原的制备和布鲁氏菌抗体快速检测试纸条(胶体金法)及其应用。
背景技术：
布鲁氏菌病(brucellosis)是由布氏杆菌08/^"//")引起的人兽共患 的传染病，俗称波浪热。临床特点为长期发热、多汗、关节疼痛、疲 乏、肝脾肿大等，此病在世界各国均有不同程度的流行。
人主要通过皮肤、黏膜、消化道和呼吸道感染，尤其以感染羊种 布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌最为严重。猪种布鲁氏菌感染人较少见，犬 种布鲁氏菌感染人罕见，绵羊附睾种布鲁氏菌、沙林鼠种布鲁氏菌基 本不感染人。
布鲁氏菌病易误诊为风湿性疾病、伤寒、结核病、病毒感染、或 作为长期发热原因待查诊治。其长期误诊的主要原因为(1)临床 医生对布氏杆菌病的认识不足是导致误诊的主要原因。(2)流行病 学资料询问不详细，特别是病史、接触史、职业、饮食习惯、居住地 区及流行地区等。(3)临床表现多样化且临床症状不典型。(4)缺乏 操作简单、快速、特异、敏感的检测手段。
目前对布鲁氏菌感染的检测主要在实验室进行。主要有
(1)病原学诊断
显微镜检査釆集流产胎衣、绒毛膜水肿液、肝、脾、淋巴结、 胎儿胃内容物等组织，制成抹片，用柯兹罗夫斯基染色法染色，镜检， 布鲁氏菌为红色球杆状小杆菌，而其它菌为蓝色。
分离培养新鲜病料可用胰蛋白月示琼脂面或血液琼脂斜面、肝 汤琼脂斜面、3%甘油0.5%葡萄糖肝汤琼脂斜面等培养基培养；37°C
培养7 ~ 10天后，进行菌落特征检查和单价特异性抗血清凝集试验。
(2) 血清学诊断主要以下几种，虎红平板凝集试验(RBPT) 全乳环状试验(MRT),试管凝集试验(SAT),补体结合试验(CFT)等。 近年来，人们用布鲁氏菌的粗提抗原研制ELISA法检测试剂盒，检测 感染血清中的抗体，取得了良好的效果。
(3) 其它如PCR，检测布鲁氏菌特异性的特异性核苷酸等。 bp26蛋白是布鲁氏菌外膜蛋白的一种，已有的研究表明，bp26
蛋白具有良好的免疫原性，而且从基因水平上看，各种布鲁氏菌 (5. "6oWw ， 5. ov&和5. me/te"^等)的bp26基因序列几乎完全 一致，只是核苷酸有微小差异，但氨基酸序列无差别。因此属于各 种布鲁氏菌的共同抗原，可作为布鲁氏菌的检测抗原，用于检测诊断。
发明内容
本发明的目的是利用布鲁氏菌的共同的外膜蛋白抗原bp26,研 制一种可以快速，准确检验布鲁氏菌抗体的快速检测试纸，检测人类 或动物血清标本中布鲁氏菌特异性抗体，用于人或动物布鲁氏菌感染 的辅助诊断。
本发明的另 一 目的在于提供上述试纸条的制备方法。 为实现上述目的，本发明首先利用基因工程技术，克隆并高效表 达布鲁氏菌共同的外膜蛋白抗原bp26,并通过免疫学技术对其免疫 原性及特异性进行检定。实验表明，通过该方法得到的外膜蛋白抗原 bp26具有良好的免疫原性及特异性。
进而，本发明利用上述方法制备的布鲁氏菌外膜蛋白bp26，研 制布鲁氏菌抗体快速检测试纸(胶体金法)，其包括反应膜和结合物 释放垫,所述反应膜具有包被的检测带和包被布鲁氏菌外膜蛋白bp26
多克隆抗体的质控带；所述结合物释放垫包被胶体金标记的布鲁氏菌 外膜蛋白bp26。
其中，反应膜可为硝酸纤维膜，结合物释放垫可为玻璃纤维膜。
本发明还提供一种制备上述检测试纸条的方法，其包括如下步
1) 制备布鲁氏菌外膜蛋白bp26及其多克隆抗体；
2) 将步骤l)制备的布鲁氏菌外膜蛋白bp26及其多克隆抗体在 反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；
3) 用胶体金标记步骤1)制备的布鲁氏菌外膜蛋白bp26，包被 到结合物释放垫中；
4) 将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反 应支持物组装成试纸条。
本发明布鲁氏菌抗体快速检测试纸(胶体金法)具有以下优点
(1) 检测快速IO分钟出结果；
(2) 特异性仅对布鲁氏菌各种人或动物血清标本呈阳性，而 对其他病原体感染的血清标本呈阴性结果；
(3) 敏感性对布鲁氏菌抗体检测高于血清凝集实验两个滴度。
(4) 保存和运输方便，在室温下可保存18个月；
(5) 便于临床和家居使用，而且具有产业性。 本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定
性半定量检测样本中可能存在的布鲁氏菌特异性抗体，可快速筛检病 人和受染动物，对布鲁氏菌的感染诊断起到辅助作用。节省了大量人 力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结 果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和流 行病学调查。
图1: A本发明试纸条的正面示意图；B本发明试纸条的侧面 示意图。其中，1:吸水垫；2:硝酸纤维膜(T:布鲁氏菌外膜蛋白bp26 的条带；C:包被抗bp26蛋白多克隆抗体的质控条带)；3:玻璃纤 维含有胶体金标记的布鲁氏菌外膜蛋白bp26; 4:金标抗体保护膜； 5:反应支持物。
图2:检测结果示意图。其中从左至右依次为T、 C两条线 阳性；C一条线阴性；T、 C两条线阴性，无效。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。
实施例l:布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因工程抗原的制备
(1) 目的基因的获得
根据目的基因片段序列(GenBank登录号为AY 166769)及 PGEX-4T-1 (Pharmacia)表达载体的特点设计两端含有限制性内协酶 五coi l、 Iol酶切位点的引物
5 ' gaattcatgaacactcgtgct 3' 5 ' gcctcgagttacttgatttcaa 3' 然后，从布鲁氏菌基因组中扩增出目的基因片断bp26,扩增条 件95。C变性5min; 95。Clmin， 49.8。Clmin, 70。Clmin,进行35个循 环；最后70。C延伸10min。
(2) 目的基因的克隆和阳性重组子的筛选 PCR扩增产物电泳后切胶回收，与PMD-18T克隆载体16t:过夜连
接后，转化到DH5a感受态细胞中，挑取单克隆菌株，37。C过夜培养， 提取质粒后，以质粒为模板进行PCR鉴定阳性克隆菌株，测定序列。
(3) bp26融合表达载体的构建
用限制性内切酶五co/ I 、 Iol分别酶切176 26和口06乂-41-1 ， 1 % 琼脂糖电泳切胶回收bp26目的片段和pGEX-4T-l双酶切后的大片段， 用T4连接酶将两者16。C过夜连接，连接产物转入BL21感受态细胞，
LB固体培养基培养8 10小时，挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用 PCR及限制性内切酶&o/M、 ^zoI双酶切分别鉴定，PCR产物和酶切 产物用1%琼脂糖电泳进行分析，筛选阳性克隆，将重组的质粒测序。
(4) pGEX-bp26融合蛋白的诱导表达
筛选出的阳性克隆菌在LB培养基中摇菌培养过夜后，将过夜菌按 照l: 100的比例接种至1000mlLB液体培养基中，37X:摇床培养。bp26 基因转化菌在接种后2小时为最佳诱导时机(OD600nm0.5)， IPTG浓 。C 0.3mmol/L， 29。C诱导8小时，目的蛋白存在于细胞裂解液上清中。
(5 ) pGEX-bp26融合蛋白的纯化、鉴定
将(4)中1000ml菌液12000r/m、 4。C离心，弃上清，将菌体用 细胞裂解液裂解，使用含有GST标签的亲和层析柱子纯化融合蛋白，
(B-PER细菌GST标签融合蛋白柱式纯化Kit货号78200赛默飞 世尔科技)，按试剂盒推荐步骤和体系进行纯化，纯化产物进行 SDS-PAGE电泳以判断纯化效果，通过紫外薄层测得产率在95%以 上。
融合蛋白的Western-Blot鉴定
切取一半胶用BioRad公司生产的半干电转仪转于硝酸纤维素膜 上，进行印迹试验， 一抗为布鲁氏菌单抗(北京博奥森生物技术有限 公司)，TMB显色后，结果有特异性蛋白条带出现。
实施例2:外膜蛋白bp26多克隆抗体的制备
(1) 动物免疫
选择1-2kg的新西兰白兔，用bp26蛋白于背部皮下多点注射，免 疫剂量为lmg/kg。共免疫4次。
(2) 免疫效价检测
包被bp26蛋白的酶标板，每孔4iig。按间接ELISA法检测免疫血 清的效价。血清效价达到l: 20000以上，可釆集血清。
(3) 抗体提纯及检定
釆用常规辛酸法提纯。纯度用非变性PAGE电泳检定，显示蛋白 一条带。活性采用ELISA检定，效价大于l: 20000。
实施例3:布鲁氏菌抗体检测试剂盒的研制
(1) 胶体金-抗原结合物的制备
经实验确定，以bp26蛋白作为金标抗原，其最佳结合pH值为8.0, 蛋白配比为46pg/ml胶体金。标记胶体金经稳定剂(0.5。/。BSA， pH8.0, O.OlMTris缓冲液)处理后，按每平方厘米65pl的量，取胶体金-抗原结 合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，冷冻干燥，并在干燥环境中保存。
(2) 包被抗原于硝酸纤维膜 将布鲁氏菌外膜蛋白bp26用0.01MPBS稀释成3.5士0.1mg/ml。将
羊抗鼠IgG多克隆抗体用0.01MPBS稀释成2士0.1mg/ml。用喷膜机将二 者以ljil/cm的速度喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线。两 条线之间的间隔为0.5cm。
把固定有抗原抗体的硝酸纤维置37t:烤箱中干燥2小时。干燥环
境中保存备用。
(3) 布鲁氏菌抗体检测试剂盒组成
反应支持物为6.5cm x 0.4cmPCV板；吸水垫为2cm x 0.4cm的滤 油纸；1.8cm x 0.4cm的硝酸纤维膜依次包被bp26蛋白，布鲁氏菌bp26 蛋白的多克隆抗体，0.4cm x 0.4cm的含有胶体金标记的布鲁氏菌 bp26蛋白的玻璃纤维；金标抗体保护膜(样品垫)为2.7cm x 0.4cm的 滤纸纤维；即形成了布鲁氏菌抗原快速检测试纸条(胶体金法)。
(4) 布鲁氏菌抗体检测试剂盒特异性及敏感度实验 特异性实验用本品检测正常的牛、羊、猪、犬血清，正常人血
清，猪瘟血清，猪空肠弯曲菌血清，兔抗鼠伤寒沙门氏菌血清，兔抗 土拉伦菌血清、兔抗耶尔森氏菌血清、兔抗大肠杆菌血清。结果均为 阴性，表明布鲁氏菌抗体检测试剂盒有良好的特异性。
敏感度实验分两部分，首先检测其对不同型布氏菌抗体的覆盖
率。用本品分别检测牛种布氏菌、猪种布氏菌、羊种布氏菌、犬种布 氏菌阳性血清，均为阳性，表明布鲁氏菌抗体检测试剂盒可检测四种
布氏菌特异性抗体。对阳性血清用ELISA试剂盒进行效价检测，并稀 释成不同的滴度，检测结果表明，本品最低检测出量为1: 32( ELISA )。
实施例4检测方法(参见图2)
将待检标本100- 150pl加入检测条的样品垫(实施例2试纸条 "4"处)上，样品液沿膜向上爬行，10-15分钟判读结果。 结果
如样本中含有布鲁氏菌抗体，则与试纸条上胶体金标记的布鲁氏 菌抗原bp26形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的布鲁 氏菌的bp26结合，形成红色线条，即在T处形成红色条带，即为阳 性结果。
无论是否含有相对应的抗体，胶体金标记的布鲁氏菌的bp26继续 向上爬行与包被在膜上的抗bp26的多克隆抗体结合，形成红色沉淀 线，即在"C"处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此 线就不会出现，说明试纸条失效。
序列表
〈110>北京庄笛浩未生物医学科技有限公司 <120〉布鲁氏菌抗体快速检测试纸条 <130> <160〉 2
〈170> Patentln version 3. 3
〈210> 1
〈211> 21
〈212> DNA 〈213〉人工序列
<400> 1
gaattcatga acactcgtgc t 21
〈210> 2
<211〉 22
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400> 2
gcctcgagtt acttgatttc aa 2权利要求
1、一种检测试纸条，其包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有包被布鲁氏菌特异性抗原bp26的检测带和包被布鲁氏菌外膜蛋白bp26多克隆抗体的质控带；所述结合物释放垫包被胶体金标记的布鲁氏菌外膜蛋白bp26。
2、 如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，其中所述布鲁氏 菌特异性抗原bp26是应用基因工程方法重组表达获得。
3、 如权利要求l或2所述的试纸条，其特征在于，所述反应膜 为硝酸纤维素膜。
4、 如权利要求l或2所述的试纸条，其特征在于，所述的结合 物释放垫为玻璃纤维膜。
5、 一种制备权利要求1 4任一项所述试纸条的方法，其包括如 下步骤1) 制备布鲁氏菌特异性抗原bp26;2) 将步骤l)制备的布鲁氏菌特异性抗原bp26及其多克隆抗体 在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；3) 用胶体金标记步骤1)制备的布鲁氏菌特异性抗原bp26,包 被到结合物释放垫中；4) 将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。
6、 权利要求1 4任一项所述试纸条在检测布鲁氏菌抗体中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测布鲁氏菌特异性抗体的快速检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有包被布鲁氏菌特异性抗原bp26的检测带和包被布鲁氏菌外膜蛋白bp26多克隆抗体的质控带；所述结合物释放垫包被胶体金标记的布鲁氏菌外膜蛋白bp26。，应用膜层析双抗原夹心法，检测标本中布鲁氏菌的特异性抗体。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对布鲁氏菌的感染诊断起到辅助作用。
文档编号G01N33/544GK101363859SQ20081011274
公开日2009年2月11日 申请日期2008年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者明 刘 申请人:北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司