专利名称：一种钩端螺旋体胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种钩端螺旋体胶体金检测 试纸条、其制备方法及其应用。
背景技术：
钩端螺旋体病(Leptospinosis，简称钩体病)是由致病性钩端螺 旋体(简称钩体)所引起的急性传染病。鼠类、猪及其它家畜为主要
传染源。接触带菌的野生动物和家畜，钩体通过暴露部位的皮肤进入 人体而获得感染的人畜共患病。发病多在夏秋割稻季节或在大雨洪水 之后。人感染钩体病后，潜伏期多在1 3周。首先形成败血症，可 有多种临床表现，包括普通型、肺出血型、黄疸出血型、脑膜脑炎型。 典型者起病急骤，早期有高热、倦怠无力、全身酸痛、结膜充血、腓 肌压痛、表浅淋巴结肿大；中期可伴有肺弥漫性出血，明显的肝、肾、 中枢神经系统损害；晚期多数病人恢复，少数病人可出现后发热、眼 葡萄膜炎以及脑动脉闭塞性炎症等。肺弥漫性出血、肝、肾功能衰竭 常为致死原因。其诊断除依据流行病学及临床症状外，实验室检测是 必不可少的，其涉及到的特异性检测有
l.病原体分离钩体不易着色， 一般显微镜很难观察到，必须采 用黑底映光法直接查找钩体。在发病IO天内可从血液及脑脊液中分 离出钩体。第二周尿中可检出钩体。钩体从体液或组织中分离需要特 殊的实验室技术和培养基。
最近用超速离心集菌后直接镜检法、荧光抗体染色法、原血片镀 银染色法及甲苯蓝染色等方法直接检查病原体，可达到快速诊断目 的，阳性率在50%左右，有助于早期诊断。
动物接种是一种分离病原体的可靠方法，将患者的血液或其他体 液接种于动物(幼年豚鼠和金黄地鼠)腹腔内，晚期病例可用尿液接 种于动物腹部皮下。接种3-5天，用暗视野检查腹腔液，亦可在接
种3 6天时取心血检查。动物接种的阳性率较高，但所需时间较长，
所需费用大。
2.血清学试验
(1)凝集溶价试验(凝溶试验)有较高的特异性和敏感性，但 需不同型别活菌搡作，凝集素一般在病后7-8天出现，逐渐升高， 以超过1:400效价为阳性，可持续数月到数年。间隔两周双份血清， 效价增高4倍以上为阳性。
(3)酶联免疫吸附试验(ELISA):比凝溶试验阳性出现时间更 早和更灵敏。发现显微镜凝集试验与ELISA的总符合率达86.2%。近 年来国外已普遍采用钩体IgM抗体技术，有高度特异性。
(3) 间接红细胞凝集试验将从钩体菌体中提取的一种抗原成 分，将其吸附于人"O"型红细胞表面致敏，遇到同种抗体，即发生 红细胞凝集现象，本试验具钩体感染的属特异性而无群或型的特异 性，较凝溶试验阳性出现早，操作简便，不需特殊设备，适合基层推 广应用。
(4) 间接红细胞溶解试验用钩体抗原物质将新鲜绵羊红细胞 致敏，在补体存在的条件下与含有抗体的血清混合时发生溶血，较间 接红细胞凝集试验的灵敏性为高。
(5) 间接荧光抗体法此法是将标准钩体菌株作成涂片，然后 将检测病人的血清滴在已知菌株的玻片上，经洗涤，如病人血清中具 有抗体，抗原抗体结合，再用抗人球蛋白荧光抗体与此复合物结合， 发生荧光，即为阳性，此法无型特异法。本法检出抗体时间及阴转时 间均较显凝试验抗体为早，具有一定的早期诊断意义。
上述各项检测，均是用已知钩体抗原检测血中出现的相应抗体，
不能做到早期诊断。近年来开展了乳胶凝集抑制试验，反向间接血凝 试验与间接荧光抗体染色试验等可以测出血中早期存在的钩体，已取 得了早期诊断的初步成果。
3. 其它诊断
(1) 钩端螺旋体DNA探针技术早已应用于临床，schoone等 1984年证实，用黄疸出血群哥本哈根型Wijnberg株DNA制备探针， 可在硝酸纤维素滤膜上检出2pg的同源DNA。且致病性钩体不同血 清群Patoc I株呈交义杂交现象。作者认为DNA探针杂交技术是一种
敏感性高的早期诊断方法。
(2) DNA基因扩增技术聚合酶链反应(PCR)的DNA扩增
技术目前已引入钩体病的诊断领域。因PCR只要有引物便可进行试 验，且方法简便，并适用于大数量标本的流行病学调查。VanEys等 1989年用PCR扩增技术对哈焦型钩体感染的牛尿作了检测研究，提 出PCRDNA扩增技术完全可作钩体病诊断的一个新型方法。
4. 钩端螺旋体膜蛋白的研究已有研究证明，ompLl和Lip32是 钩端螺旋体的主要膜蛋白，特别是Lip32是已知膜蛋白中含量最高的。 ELISA研究证实，ompLl和Lip32在感染动物的体内有大量的表达， 均具有良好的免疫原性。
以上操作需要专业技术人员在专业实验室进行，技术条件要求 高、设备比较昂贵、无法处理大量可疑标本，在检测时间上也达不到 快速筛查的目的。针对钩端螺旋体病的流行现状和防治要求，对于该 病的诊断，不但要求高的特异性和敏感性，还需要快速、简便、易于 基层医疗和卫生单位使用。
胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay)始于上世纟已 90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的。它是免疫亲和 技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗原、胶 体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层
析诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就 可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，搡作更简便、快速， 且由于为试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测钩端螺旋体 的胶体金试纸条，检测人类中钩端螺旋体属特异性抗原，用于钩端螺 旋体的辅助诊断。
本发明的另 一 目的是提供 一 种钩端螺旋体胶体金检测试纸条的 制备方法。
本发明的再一目的是提供一种钩端螺旋体胶体金检测试纸条的 应用。
本发明提供了一种钩端螺旋体胶体金检测试纸条，其包含同时 包被钩端螺旋体属特异性抗原LipL32的单克隆抗体或抗钩端螺旋体 属特异性抗原的多克隆抗体和二抗IgG两个条带的硝酸纤维膜；及含 有胶体金标记钩端螺旋体特异性抗原LipL32的单克隆抗体的玻璃纤 维膜。
其中，所述钩端螺旋体特异性抗原LipL32是应用基因工程方法 重组表达获得。
所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。
所述硝酸纤维膜中钩端螺旋体特异性抗原LipL32或抗钩端螺旋 体特异性抗原的多克隆抗体的浓度为l 1.5mg/ml，所述抗鼠IgG抗体 的浓度为2 3mg/ml，釆用0.01MPBS进行稀释。
所述玻璃纤维膜中胶体标记的钩端螺旋体特异性抗原的单克隆 抗体的pH值为7.6-8.0,胶体金和抗体的配比为以24叱/ml胶体金。
本发明钩端螺旋体抗原检测试纸条，还包括反应支持物、金标抗 体保护膜和吸水垫，所述反应支持物上依次相互搭接粘贴的金标抗体 保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。
所述反应支持物优选PVC板；所述吸水垫优选滤油纸；所述金 标抗体保护膜同时具有吸水功能，优选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤 维。
本发明钩端螺旋体抗原检测试纸条的制备方法，包括如下步骤 1 )制备钩端螺旋体特异性抗原LipL32或抗钩端螺旋体特异性抗
原的多克隆抗体；
2)硝酸纤维膜的制备将钩端螺旋体特异性抗原LipL32的单克 隆抗体或抗钩端螺旋体特异性抗原的多克隆抗体稀释成1~1.5mg/ml， 将抗鼠IgG抗体稀释成2 3mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测 线和对照线，且于37"C中干燥2小时，备用；
3) 玻璃纤维膜的制备单克隆抗体胶体金标记的最适pH值为 7.6 8.0，单克隆抗体与胶体金的最佳配比为24ng/ml胶体金，经稳定 剂(含0.5。/。BSA, pH8.0， O.OMTris缓冲液)处理后，按每平方厘米 65pl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；
4) 最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻 璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。
本发明钩端螺旋体抗原检测试纸条在检测钩端螺旋体中的应用。 本发明釆用纯化的钩端螺旋体属特异性抗原LipL32的单克隆抗 体或抗钩端螺旋体属特异性抗原的多克隆抗体和抗鼠IgG抗体分别 固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的钩端螺旋体属特异 性抗原LipL32的单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法的原理检测 标本中的钩端螺旋体。
本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定 性半定量检测样本中可能存在的钩端螺旋体，达到快速筛检病人，及 时控制疫情的目的。同时也可用于外环境样本增菌后的快速筛査。为 下一步的分离鉴定创造成了有利条件，节省了大量人力物力，方便、 快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操
作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测， 适合流行病学调查，对钩端螺旋体的感染诊断起到辅助作用。
图1A为本发明钩端螺旋体胶体金检测试纸条的正面示意图； 图IB为本发明钩端螺旋体胶体金检测试纸条的侧面示意图； 其中，1:吸水垫
2:硝酸纤维膜(T:钩端螺旋体属特异性抗原LipL32的单克隆 抗体或抗钩端螺旋体属特异性抗原的多克隆抗体的条带；C:包被抗 鼠IgG抗体的质控条带)
3:含有胶体金标记钩端螺旋体属特异性抗原LipL32的单克隆抗 体的玻璃纤维膜
4:金标抗体保护膜
5:反应支持物
图2为本发明试纸条检测结果示意图。
其中，从左至右依次为T、 C两条线阳性；C一条线阴性；T、 C两条线阴性，无效。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。
实施例1钩端螺旋体属特异性抗原LipL32的克隆表达 (1) LipL32 (登录号为AM936999)基因的扩增 根据目的基因片段序列设计引物 LipL32引物序列
5 , GCCGAATTCATGAAAAAACTTTCGATTTTG 3, 5 ' GCCCTCGAGTTACTTAGTCGCGTCAGAAGC 3' PCR参数:95°C 5min， 95。Clmin, 50。C30s, 70。Clmin， 30个
循环。最后70。C延伸10min。
(2) 目的基因的克隆和阳性重组子的筛选 将两种PCR扩增产物电泳后切胶回收，与PMD-18T克隆载体16"C
过夜连接后，转化到DH5a感受态细胞中，挑取单克隆菌株，37°。过 夜培养，提取质粒后，以质粒为模板进行PCR鉴定阳性克隆菌株，测 定序列。
(3) 融合表达载体的构建
用限制性内切酶EcoRl、 Xhol分别酶切T/LipL32和pGEX-4T-l， 1%琼脂糖电泳切胶回收目的片段和pGEX-4T-l双酶切后的大片段，用 T4连接酶16。C过夜连接，连接产物转入BL21感受态细胞，LB固体培 养基培养8 10小时，挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用PCR及限制 性内切酶EcoRI、 Xhol双酶切分别鉴定，PCR产物和酶切产物用in/。琼 脂糖电泳进行分析，筛选阳性克隆，将重组的质粒测序。
(4) 蛋白的诱导表达 筛选出的阳性克隆菌在LB培养基中摇菌培养过夜后，将过夜菌
按照l:100的比例接种至1000mlLB液体培养基中，37"C摇床培养。基 因转化菌在接种后2小时为最佳诱导时机(OD600nm 0.5), IPTG浓度 为0.5mmol/L, 29'C诱导表达8小时。
(5) 表达蛋白的纯化、鉴定
将(4)中1000ml菌液12000r/m、 4。C离心，弃上清，将菌体用细 胞裂解液裂解，使用含有GST标签的亲和层析柱子纯化融合蛋白，用 GST-融合蛋白纯化试剂盒(B-PER细菌GST标签融合蛋白柱式纯化 Kit货号78200赛默飞世尔科技)，按试剂盒推荐步骤和体系进行 纯化，纯化产物进行SDS-PAGE电泳以判断纯化效果，通过紫外薄层 测得产率在95%以上。
融合蛋白的Western-Blot鉴定
切取一半胶用BioRad公司生产的半干电转仪转于硝酸纤维素膜
上，进行印迹试验， 一抗为钩端螺旋体单抗(北京博奥森生物技术有 限公司)，TMB显色后，结果有特异性蛋白条带出现。
实施例2 钩端螺旋体属特异性抗原LipL32多克隆抗体的制备
(1) 动物免疫
选择l 2kg的新西兰白兔，用钩端螺旋体属特异性抗原LipL32蛋 白于背部皮下多点注射，免疫剂量为0.5 lmg/kg。共免疫3 5次。
(2) 免疫效价检测 包被钩端螺旋体属特异性抗原LipL32蛋白酶标板，每孔4(ig。按
间接ELISA法检测免疫血清的效价。血清效价达到l: 20000以上，可 釆集血清。
(3) 抗体提纯及检定
采用常规辛酸法提纯。纯度用非变性PAGE电泳检定，显示蛋白 一条带。活性釆用ELISA检定，效价大于l: 20000。 实施例3 钩端螺旋体属特异性抗原LipL32单克隆抗体的制备 (1)免疫小鼠
将基因工程抗原从-2(TC低温冰箱取出溶解后，给BALB/C小鼠背 部皮下注射(0.2ml/只)，间隔10天。融合前3日，在小鼠腹腔以抗原 0.15ml进行攻击。免疫效果用ELISA法进行检测。
(2) 骨髓瘤细胞
SP2/0骨髓瘤细胞用时将存储在液氮罐中的SP2/0细胞复苏，在 含有10。/。小牛血清DMEM培养基中培养48 72小时，待细胞生长良好， 细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈对数分裂，准备融合。
(3) 细胞融合
制备好的SP2/0细胞和免疫的BALB/C小鼠的脾淋巴细胞分别配 制成2 x 1()7/ml和l x l08/ml。各取lml室温下混合。用0.8ml， 50。/o的PEG (分子量1—500 )作为融合剂；培养液用10%小牛血清DMEM。
(4) 阳性孔的检测和筛选
ELISA法检测。包被A毒素抗原酶标板。对融合细胞的培养上清 液进行检测，选择ELISA效价OD值大于1.0的阳性孔进行亚克隆。共 检出阳性克隆52株，选择15株进行亚克隆操作。
(5) 单抗细胞株的亚克隆 用有限稀释法对阳性克隆细胞株进行克隆化筛选。对筛选的的阳
性克隆经过冻存、复苏、传代等过程，最终获得8株可稳定分泌特异 性抗艰难梭菌A毒素的单克隆抗体细胞株。
(6) 单克隆抗体细胞株检定
细胞株核型分析对上述杂交瘤细胞染色体进行检测为96条；证 明他们是SP2/0骨髓瘤与小鼠细胞的杂交瘤细胞。
细胞株稳定性对8株产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株经连续克 隆化检测单克隆抗体阳性率100%，在体外传代5个月，并经反复冻存 复苏均能达到保持稳定的分泌抗体，培养上清ELISA效价大于1: 1000。
(7) 单抗腹水制备
小鼠SPF级小鼠，经检査无鼠源病毒污染，在腹水生产过程中 如发现动物不健康、咬伤、感染者应弃掉。
细胞株扩大培养取生产批细胞管l支复苏，加营养液扩大培养， l只生产细胞只用一次，不再冻存。
杂交瘤细胞株接种制备腹水均需在无菌条件下进行，注射杂交 瘤细胞之前，每只小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml。 一周后每只小鼠腹 腔注射杂交瘤细胞l 3xl0V0.2ml。
腹水釆集注射细胞株7 10天，或小鼠濒死前一次釆集腹水，置 -2(TC保存。
(8) 单克隆抗体的提纯
釆用硫酸铵沉淀法粗提，进而用HiTraprProteinA柱纯化，经SDS -PAGE电泳检定，仅显示单一蛋白带。
12
(9) 抗体亲合力测定
釆用NaSCN竞争ELISA实验，测定其ED5o的下降值，来间接反映 其抗体亲合力的大小。
(10) 亚型检定 釆用免疫扩散法对细胞培养上清的单抗进行Ig亚类的检测。
(11) 抗原位点检定
用相加ELISA法对8株单抗的抗原结合位点进行检测。从而筛选 出配对单克隆抗体。
实施例4:钩端螺旋体胶体金快速检测试纸条(参见图l)
(1) 胶体金-LipL32单克隆抗体结合物的制备
经实验确定，抗LipL32单克隆抗体胶体标记的其最佳结合pH值为 8.0，胶体金和抗体的配比为24!ig/ml胶体金。标记胶体金经稳定剂(含 0.5%BSA, pH8.0， O.OMTris缓冲液)处理后，按每平方厘米65pl的量， 取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，冷冻干燥，并 在干燥环境中保存。
(2) 包被抗体于硝酸纤维膜
将LipL32的另 一株单克隆抗体或抗钩端螺旋体属特异性抗原的 多克隆抗体用O.OIMPBS稀释成1.2mg/ml。将抗鼠IgG多克隆抗体用 0.01MPBS稀释成2mg/ml。用喷膜机将二者以1(il/cm的速度喷于硝酸 纤维膜上，分别形成检测线和对照线。两条线之间的间隔为0.5cm。
把固定有抗体的硝酸纤维置37'C烤箱中干燥2小时。干燥环境中 保存备用。
(3) 钩端螺旋体检测试剂盒组成
反应支持物5为6.5cm x 0.4cmPCV板；吸水垫l为2cm x 0.4cm的 滤油纸；1.8cmx0.4cm的硝酸纤维膜3依次包被抗鼠IgG，钩端螺旋体 属特异性表达蛋白LipL32的单克隆抗体，0.4cm x 0.4cm的含有胶体金 标记的抗LipL32的单克隆抗体的玻璃纤维膜3;金标抗体保护膜4 (样
品垫)为2.7cmx0.4cm的滤纸纤维；即形成了钩端螺旋体抗体检测试 纸条(胶体金法)。
(4)钩端螺旋体检测试剂盒特异性及敏感度实验
使用步骤3的检测试剂盒(检测带为单克隆抗体)进行实验 特异性实验制备以下阴性质控品大肠杆菌、Ol群霍乱弧菌、 0139群霍乱弧菌、空肠弯曲菌、痢疾杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶 血弧菌、布氏菌。检测结果表明，钩端螺旋体检测试剂盒有良好的特 异性。
敏感度实验用钩端螺旋体检测试剂盒基因工程抗原标本，其最 低检出量为2ng/ml。 实施例5 检测方法(参见图2)
将待检标本(尿液、全血、血浆或血清)直接滴加入实施例2试 纸条"4"处，样品液沿膜上行，10 15分钟判读结果。
结果
如样本中含有钩端螺旋体抗原，则与试纸条上胶体金标记的钩端 螺旋体属特异性抗原LipL32的单克隆抗体形成相应的复合物，上行 与包被在硝酸纤维膜上的钩端螺旋体属特异性抗原的单克隆抗体或 抗钩端螺旋体属特异性抗原的多克隆抗体，形成红色线条，即在T处 形成红色条带。
无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记钩端螺旋体属特异性抗 原的单克隆抗体继续向上爬行与包被在膜上的抗鼠IgG形成红色沉 淀线，即在"C"处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效， 此线就不会出现，说明试纸条失效。
钩端螺旋体胶体金快速检测试纸条特异性实验 根据钩端螺旋体病的发病机理，本产品与下述样品进行交叉反应 性实验，包括正常人血清、鼠疫伤寒沙门氏菌、流感病毒、梅毒螺 旋体、布氏杆菌、结核杆菌、大肠杆菌、空肠弯曲菌。检测结果均为
阴性，表明本品与上述菌无交叉反应。
钩端螺旋体胶体金快速检测试纸条敏感度实验
用本品检测钩端螺旋体基因工程抗原的不同浓度的样品，其最低
检测量为lng/ml。
虽然，上文中已经用 一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
〈110〉北京庄笛浩未生物医学科技有限公司
<120〉 一种钩端螺旋体胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用
<130>
<160 2
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA 〈213〉人工序列
<400〉 1
gccgaattca tgaa肌aact ttcgattttg 30
<210> 2
<211> 30
<212> 醒 <213〉人工序列
〈400〉 2
gccctcgagt tacttagtcg cgtcagaagc 30
权利要求
1、一种钩端螺旋体胶体金检测试纸条，其特征在于，其包含同时包被钩端螺旋体属特异性抗原LipL32的单克隆抗体或抗钩端螺旋体属特异性抗原的多克隆抗体和二抗IgG两个条带的硝酸纤维膜(2)；及含有胶体金标记钩端螺旋体特异性抗原LipL32的单克隆抗体的玻璃纤维膜(3)。
2、 根据权利要求1所述钩端螺旋体胶体金检测试纸条，其特征 在于，所述钩端螺旋体特异性抗原LipL32是应用基因工程方法重组 表达获得。
3、 根据权利要求1或2所述钩端螺旋体胶体金检测试纸条，其 特征在于，所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。
4、 根据权利要求3所述钩端螺旋体胶体金检测试纸条，其特征 在于，所述硝酸纤维膜中钩端螺旋体特异性抗原LipL32的单克隆抗 体或抗钩端螺旋体特异性抗原的多克隆抗体的浓度为1 1.5mg/ml，所 述抗鼠IgG抗体的浓度为2 3mg/ml。
5、 根据权利要求1-4任意一项所述钩端螺旋体胶体金检测试纸 条，其特征在于，所述玻璃纤维膜中胶体标记的钩端螺旋体特异性抗 原LipL32的单克隆抗体的pH值为7.6~8.0，胶体金和抗体的配比为 24pg/ml胶体金。
6、 根据权利要求1-5任意一项所述钩端螺旋体胶体金检测试纸 条，其特征在于，还包括反应支持物(5)、金标抗体保护膜(4)和 吸水垫(1)，所述反应支持物(5)上依次相互搭接粘贴的金标抗体 保护膜U)、玻璃纤维膜(3)、硝酸纤维膜(2)和吸水垫(1)。
7、 一种制备权利要求6所述钩端螺旋体胶体金检测试纸条的方 法，包括如下步骤1 )制备钩端螺旋体特异性抗原LipL32的单克隆抗体或抗钩端螺 旋体特异性抗原的多克隆抗体； 2)硝酸纤维膜的制备将钩端螺旋体特异性抗原LipL32的单克 隆抗体或抗钩端螺旋体特异性抗原的多克隆抗体稀释成1~1.5mg/ml， 将抗鼠IgG抗体稀释成2 3mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测 线和对照线，且于37"C中干燥2小时，备用；3) 玻璃纤维膜的制备将胶体金调整抗体pH值为7.6 8.0,以 24pg/ml胶体金加入钩端螺旋体特异性抗原的单克隆抗体，经稳定剂 处理后，按每平方厘米65pl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥, 备用；4) 最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻 璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。
8、权利要求1-6任意一项所述钩端螺旋体胶体金检测试纸条在 检测钩端螺旋体中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种钩端螺旋体胶体金检测试纸条，其是在硝酸纤维膜(NC膜)上包被钩端螺旋体属特异性抗原LipL32的单克隆抗体或抗钩端螺旋体属特异性抗原的多克隆抗体和质控二抗IgG，结合胶体金标记的钩端螺旋体属特异性抗原LipL32的单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法，检测标本中钩端螺旋体。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对钩端螺旋体的感染诊断起到辅助作用。
文档编号G01N33/558GK101363868SQ200810112739
公开日2009年2月11日 申请日期2008年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者明 刘 申请人:北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司