布鲁氏菌的非编码小rna分子bsr0601及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明布鲁氏菌的非编码小RNA分子BSR0601及其应用，提供了一个来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子BSR0601。Northern?blot实验证实了BSR0601与布鲁氏菌的胞内生存相关。通过构建BSR0601的缺失突变株和过表达株，表明BSR0601过表达以后，布鲁氏菌在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力明显减弱，而且在小鼠体内的生存能力也下降，还表明BSR0601与布鲁氏菌的毒力相关，BSR0601过表达以后，布鲁氏菌的毒力减弱。因此，可以BSR0601过表达载体为活性成分制备抗布鲁氏菌药物。本发明将在布鲁氏菌病的预防和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。
【专利说明】布鲁氏菌的非编码小RNA分子BSR0601及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及细菌非编码小RNA (small non-coding RNA, sRNA),特别是涉及一个来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子BSR0601及其功能鉴定与应用。
【背景技术】
[0002]细菌非编码小RNA (small non-coding RNA，sRNA)是近年来在细菌等原核生物中发现的一类RNA调控子，它们不编码蛋白质，通常位于基因间区，长度在50~500个核苷酸之间，广泛参与体内多种生命活动的调控。细菌sRNA是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子，在应对环境变化的基因表达调控中发挥重要作用。sRNA主要通过碱基配对与靶标mRNA结合来发挥生物调控作用。迄今为止，大部分细菌sRNA的研究集中在大肠杆菌等模式生物，但随着研究的深入，已有越来越多的研究转向致病菌，如霍乱弧菌、产单核细胞李斯特菌、铜绿假单胞菌、结核杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等。在这些病原菌中，已经证实sRNA在转录后水平调控基因的表达，并在压力应答和毒力调控中发挥重要作用。
[0003]布鲁氏菌病是由布鲁氏菌入侵机体引起的人畜共患传染病，在我国广泛流行，不仅给我国畜牧业生产造成巨大的经济损失，也严重威胁人民的健康生活，是一个重要的公共卫生问题。布鲁氏菌是胞内寄生菌，主要寄生于机体的单核细胞(主要是巨噬细胞)内，胞内生存和复制是布鲁氏菌致病的关键，而适应胞内的环境又是布鲁氏菌实现胞内生存的关键。因此，了解布鲁氏菌如何适应胞内的恶劣环境并在其中生存对于理解布鲁氏菌的致病机理至关重要。由于sRNA是细菌适应环境压力的重要调节因子，发明人推测识别布鲁氏菌的sRNA并对其功能进行研 究将有助于理解布鲁氏菌的致病机理。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是提供一个与布鲁氏菌的胞内生存和毒力相关的来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子。
[0005]本发明所提供的来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子(small non-coding RNA,sRNA)，命名为BSR0601，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，或与序列表中SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与布鲁氏菌毒力和生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQ IDNO:1所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。
[0006]BSR0601缺失突变载体和BSR0601过表达载体也属于本
【发明内容】
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[0007]所述BSR0601缺失突变载体具体可为BSR0601-NC-T，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2 所示。
[0008]所述BSR0601过表达载体具体可为BSR0601-MCS，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO:3 所示。
[0009]转化有BSR0601缺失突变载体的布鲁氏菌BSR0601缺失突变株和转化有BSR0601过表达载体的布鲁氏菌BSR0601过表达株也属于本
【发明内容】
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[0010]以布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M为出发菌株,构建的BSR0601缺失突变株为 16MABSR0601。
[0011]以布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M为出发菌株,构建的BSR0601过表达株为16M-BSR0601。
[0012]BSR0601过表达后布鲁氏菌的毒力和生存能力减弱，因此，可以BSR0601过表达载体为活性成分制备抗布鲁氏菌药物。
[0013]因此，非编码小RNA分子BSR0601在与布鲁氏菌的胞内生存和/或毒力相关的研究试剂或药用产品(如，抗布鲁氏菌药物)制备中的应用也属于本
【发明内容】
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[0014]本发明用生物信息学的方法从布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M的染色体序列庞杂的信息中预测和分析出一个与布鲁氏菌的胞内生存和毒力相关的布鲁氏菌非编码小RNA BSR0601。Northern blot实验证实了 BSR0601与布鲁氏菌的胞内生存相关。通过构建BSR0601的布鲁氏菌缺失突变株和过表达株，对BSR0601的功能进行了分析，实验结果表明:BSR0601过表达以后，布鲁氏菌在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力明显减弱；此外，BSR0601还与布鲁氏菌的毒力相关，BSR0601过表达以后，布鲁氏菌的毒力减弱。因此，可以BSR0601过表达载体为活性成分制备抗布鲁氏菌药物。本发明将在布鲁氏菌病的预防和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。
[0015]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为BSR0601在布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M不同生长时期表达情况的Northern blot检测结果
[0017]图2为BSR0601在酸、热、营养缺乏、氧化应激等模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的转录情况
[0018]图3A为BSR0601缺失突变载体BSR0601-NC-T的物理图谱
[0019]图3B为BSR0601过表达载体BSR0601-MCS的物理图谱
[0020]图 4 为 BSR0601 突变株 16M Δ BSR0601 和 BSR0601 过表达株 16M-BSR0601 的 RT-PCR
鉴定结果
[0021]图5 为 BSR0601 突变株 16M Δ BSR0601 和 BSR0601 过表达株 16M-BSR0601 在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力分析结果
[0022]图6 为 BSR0601 突变株 16M Δ BSR0601 和 BSR0601 过表达株 16M-BSR0601 的小鼠
毒力竞争实验结果
【具体实施方式】
[0023]在了解布鲁氏菌如何适应胞内的恶劣环境及其致病机理中，基于sRNA是细菌适应环境压力的重要调节因子，发明人推测sRNA应该在布鲁氏菌的胞内生存和毒力中发挥一定的作用。鉴于此，发明人用生物信息学的方法从布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M的染色体序列庞杂的信息中找到一个与布鲁氏菌的胞内生存和毒力相关的布鲁氏菌非编码小RNA BSR0601。本发明对布鲁氏菌的sRNA BSR0601进行了鉴定及相关功能分析，并最终确定了
【发明内容】
，以下详述。
[0024]本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见“〈MolecularCloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David ff.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd edition,2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0025]所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
[0026]实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0027]所用引物和探针由大连宝生物公司合成，质粒由上海生工生物工程有限公司合成。
[0028]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1、获得布鲁氏菌的非编码小RNA分子BSR0601的序列
[0029]从NCBI(ftp://ftp.ncb1.nih.gov/genomes/Bacteria/)下载布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M的染色体序列(NC_003317.1和NC_003318.1两条染色体，命名为I和II)，从下载的序列中提取基因间区(指的是两个开放阅读框之间的序列)片段。在基因间区用pftools2.3(http://www.1srec.1sb-sib.ch/ftp-server/pftools/)寻找启动子(cut-off(阈值)值取255 (对启动子的寻找设定一个限制条件)，用RNAMotif寻找终止子，其中的motif descriptor (主题描述符,作用是用于终止子的寻找)来自(http://www.tufts, edu/sackler/waldorlab/sRNA`Predict/),然后再在去冗余(指的是重复的序列)基础上预测出具有完整转录单元的基因间区，去除含有tRNA和rRNA的序列，最后，通过BLAST比对，找出保守的基因间区作为候选的(small non-coding RNA, sRNA)序列。候选的sRNA序列数量为21个。
[0030]在候选的sRNA序列中，分析得知，BSR0601是在布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M II号染色体上预测的非编码小RNA，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1所示，其5’端为635957 (指的是Genbank里面的序列号),3’端为636123 (指的是Genbank里面的序列号)，长167nt，其编码基因位于布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M的BMEI10601 (指的是Genbank里面的位点号码)和BMEI10602 (指的是Genbank里面的位点号码)之间的基因间区。由于BSR0601的转录方向与两侧的放性阅读框(ORF)均相反，说明BSR0601是单独转录的，符合sRNA的特征。BLAST比对结果表明，BSR0601在布鲁氏菌菌种间的同源性达到100%，说明BSR0601具有高度的保守性，这一点也符合sRNA的特征。
[0031]实施例2、BSR0601在布鲁氏菌16M不同生长时期表达情况的Northern blot验证
[0032]Northern blot是鉴定非编码小RNA的金标准。由于非编码小RNA的表达通常具有生长时期依赖性，因此，可用Northern blot检测BSR0601在布鲁氏菌16M不同生长时期的表达情况。具体方法包括以下步骤:
[0033]I)根据BSR0601的编码序列设计引物，并在反向引物外侧添加T7启动子序列，弓丨物序列为 BSR0601-p-F:CCAATCCCAACTITTGTCCAG 和 BSR0601-p-R: TAATACGACTCACTATAGGGGGCGGCGTTTTCGTTTC (带下划线序列为T7启动子序列)。
[0034]2)首先以羊布鲁氏菌16M的基因组为模版，用引物BSR0601-P-F和BSR0601-p-RPCR扩增制备探针的DNA模板，PCR反应体系为:10Xbuffer2.5 μ 1，dNTPs (2.5mmol/L)2y I，上游引物(10 μ mol/L) 0.5 μ I，下游引物(10 μ mol/L) 0.5 μ 1，EXTaq (5U/mL)0.2y 1，模板 DNA 3 μ 1，ddH2017 μ 1，总体积 25 μ I。PCR 反应条件为:95°C7min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，30 个循环；72°C IOmin0
[0035]3)以步骤2)获得的DNA为模板，用T7聚合酶体外转录制备BSR0601的地高辛标记探针，转录体系为:模板DNAl μ g, DIG-11-UTP Mix2 μ 1, 5 X Transcription buffer4 μ 1，RiboLock?RNase Inhibitor(40U/μ I) I μ I, T7RNA Polymerase(20U/μ 1)1.5 μ 1，DEPC水定容到20 μ 1，混匀。转录条件为:在PCR仪中37°C体外转录反应a ;加入I μ I DNase I(2U/y I) 37°C处理消化DNA30min ;然后加入2μ I EDTA (0.2Μ，ρΗ8.0)终止反应；加入30 μ I DEPC处理过的水，使总体积达到50 μ I ;加入1/10体积的5Μ乙酸铵(5 μ I)涡旋混匀和3倍体积预冷的无水乙醇(150 μ 1)，-20°C放置过夜；12，000rpm、4°C离心15min，75%乙醇漂洗2次，弃上清，空气干燥。用50μ1 DEPC水溶解RNA探针。并向其中加入20U RNaseInhibitor, 5 μ I 分装，_80°C保存。 [0036]探针序列为:
[0037]CCAATCCCAACTTTTGTCCAGTTGGGCGGCGGAAGAACGTTCTCTTTGAGGGCATTGAAACGGTATGGATGCGGGATAGCAAAGCAGCTTGAAGAAACGAAAACGCCGCC。
[0038]4)将布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M分别培养至对数生长早期(EP,OD600=0.5)、中期(MP，OD6tl0=L 2)和平台期(ST，0D_=2.5)，采用 Trizol 法提取布鲁氏菌 16M的总RNA,以布鲁氏菌的总RNA为模版,用步骤3)制备的探针进行Northern blot验证。
[0039]Northern blot验证结果如图1 (EP表示对数生长早期,MP表示对数生长中期,ST表示平台期)所示，BSR0601在布鲁氏菌16M的对数生长中期和平台期有转录，证明在布鲁氏菌16M中确实存在BSR0601。
[0040]实施例3、BSR0601在模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的表达分析
[0041]细菌sRNA的表达与应激条件有关，因此，可用RT-PCR的方法对BSR0601在酸、营养缺乏、氧化应激等模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的转录情况进行了检测。具体方法包括以下步骤:
[0042]I)将培养至对数生长中期(OD6qq=L 2)的布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M菌液进行离心，收集菌体，将菌体分别在①TSB7.0 (大豆胰蛋白胨肉汤，购自生物梅里埃公司，pH为7.0，为标准37°C )、②GEM7.0(营养缺乏培养基，每升培养基中含MgSO4.7H200.2g，Citric acid.Η202.0g, K2HPO4I0.0g, NaNH4HPO4.4Η203.5g，葡萄糖 20g,调 pH 为 7.0)、③ TSB7.0，42°C (热刺激)、④ TSB4.0 (酸性条件，pH 为 4.0)、⑤ TSB7.0，1.5mM H2O2 (高氧)五种条件下培养30min。
[0043]2)采用Trizol法提取在不同条件培养的布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M的 RNA，RNA 用 DNAse I 消化后作为模版，用引物 BSR0601-RT-F:CCAATCCCAACTTTTGTCCAG和 BSR0601-RT-R:GGCGGCGTTTTCGTTTC 检测 BSR0601 的表达水平，用引物 16sRNA_RT_F:CACTGGACCATTACTGACGC 和 16sRNA_RT_R:ACTAAGGGCGAGGGTTGC 检测 16S rRNA 的表达水平，16S rRNA为阳性内对照基因，25μ I PCR反应体系为:2XonestepSYBR RT-PCRBufferl2.5 μ I, Takara ExTaqC5U/ μ 1)0.5 μ I,RT Enzyme Mix H0.5 μ I,Forward primer(10 μ M) I μ I, Reverse primer (10 μ M) I μ I, RNase free Η208.5 μ I, Total RNAlOOng ；PCR 反应条件为:42°C 5min ；95°C IOs ；95°C 5s, 56°C 30s, 72°C 30s，45 个循环。
[0044]3)相对定量的计算采用2_Λ "et方法分析，即ACt目标基因=Ct(目标基因)_Ct(同一样本16S rRNA) ； Δ Δ Ct目标基因=ACt目标基因(实验组)-ACt目标基因(对照组)，相对倍数(实验组/对照组实验进行3次，以TSB7.0条件为对照组(相对转录水平设为I )，其余条件为实验组。重复实验3次，计算平均值。
[0045]检测结果如图2所示，可以看出，BSR0601在酸(TSB4.0)、营养缺乏(GEM7.0)、氧化应激条件(H2O2)和热(42°C)等模拟巨噬细胞内环境的应激条件下的表达量明显增加，提示BSR0601可能与布鲁氏菌适应巨噬细胞内环境和细胞内生存有关。
[0046]实施例4、BSR0601的功能分析
[0047]为了进一步分析BSR0601在布鲁氏菌胞内生存和毒力中发挥的作用，构建了BSR0601的缺失突变株和过表达株，并进行了相关表型实验。
[0048]UBSR0601缺失突变株和过表达株的构建及验证
[0049]以布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M的基因组DNA为模板，用引物BSR0601-N-F 和 BSR0601-N-R 扩增 BSR0601 的 N 端同源臂，用引物 BSR0601-C-F 和BSR0601-C-R扩增BSR0601的C端同源臂。以PUC19K (购自大连宝生物公司)为模板，用引物Kana-F和Kana-R扩增卡那霉素抗性基因(Kan基因)。PCR扩增产物用DNA胶纯化回收试剂盒(购自Promega公司)回收后，将N端同源臂、C端同源臂和Kan基因等摩尔比混合作为模板，进行融合PCR扩增 。PCR扩增分两轮进行，分别命名为PCR-1和PCR-2。
[0050](I)引物序列
[0051 ] BSR0601-N-F:GTACAAAAAAGCAGGCTTAGGTACCACGATATAGGGATTGGAGAAG
[0052]BSR0601-N-R:GCTGACATTCATCCCAGGTGGCACTCACAATATTTCAATAATTG ；
[0053]BSR0601-C-F:ACTCTGGGGTTCGAAATGACCGTGATCTTGATTCACGATGTTG
[0054]BSR0601-C-R:TGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGATTACGAAACCATCTGCTCCG ；
[0055]Kan-F:ATCAGGACATAGCGTTGGC
[0056]Kan-R:GGCAAGAAAGCCATCCAGT ；
[0057]pBBR-F:GCGAAAGGGGGATGTGCTGC
[0058]pBBR-R:AGCGCGCAATTAACCCTCAC ；
[0059]BSR16-RT-F: CCAATCCCAACTTTTGTCCAG
[0060]BSR16-RT-R:GGCGGCGTTTTCGTTTC ；
[0061]16sRNA-RT-F: CACTGGACCATTACTGACGC
[0062]16sRNA-RT-R:ACTAAGGGCGAGGGTTGC。
[0063](2)融合PCR扩增
[0064]PCR-1反应体系:
[0065]Pyrobest polymerase0.2 μ 1，
IOXPCR Buffer (Mg2+ Plus)2μ l,
dNTP Mixture (各 2.5mM)2 μ 1，
模板3 μ l，
加去离子水.个:2.5 μl;
[0066]PCR-1 反应条件:94°C 5min ；94°C 30s，66°C 30s，72°C 60s, 10 个循环。
[0067]将得到的PCR-1液稀释10倍作为第二步PCR(PCR_2)的模板，进行第二轮PCR扩
士豳
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[0068]PCR-2反应体系:
[0069]
LA polymerase0.5 μ l,
IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus)5 μ 1，
dNTP Mixture(2.5mM each)4μ l,
BSR0601-N-F (20 μ Μ)1μ l,
BSR0601-C-R (20 μ Μ)1μl,
模板3μ l,
加去离子水至50μl;
[0070]PCR-2 反应条件-MV 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s, 30 个循环；72°C IOmin0将PCR-2反应产物用DNA胶纯化回收试剂盒进行切胶回收，得到的回收片段即为BSR0601缺失突变盒，将其命名为BSR0601-NC。
[0071](3)构建BSR0601缺失突变载体
[0072]将缺失突变盒BSR0601-NC和pMD18-T Simple Vector(购自大连宝生物公司)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，将转化产物涂布氨苄(100μ g/mL)抗性LB平板，对平板上的抗性克隆用引物BSR0601-N-F和BSR0601-C-R进行菌落PCR鉴定。扩增出2077bp DNA片段(此DNA片段为BSR0601-NC)的为阳性克隆，将鉴定为阳性的克隆提取质粒，对质粒用Kpn I酶和HindIII酶进行双酶切鉴定，经双酶切获得4579bp (此DNA片段为BSR0601-NC-T/Kpn I +HindIII^P190bp (此 DNA 片段为 BSR0601-NC_T/Kpn I +HindIII)DNA片段的阳性质粒，表明BSR0601缺失突变载体BSR0601-NC-T构建成功，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示,物理图谱如图3A所示。
[0073](4) BSR0601缺失突变株的筛选与鉴定
[0074]将缺失突变载体BSR0601-NC-T质粒DNA与80 μ I布鲁氏菌(Brucellamelitensis) 16M感受态细胞充分混匀，预冷15min,然后于18kV/cm、400Q条件下进行电击，电击后立即加入ImL TSB培养基重悬细菌，转入1.5mL离心管中37V复苏24h，复苏后的转化产物经系列稀释后涂布含有50 μ g/mL卡那霉素的TSA平板，37°C培养72h以上，筛选卡那霉素抗性克隆，即为BSR0601缺失突变株，将其命名为16MABSR0601。
[0075](5)构建BSR0601过表达载体[0076]以布鲁氏菌(Brucellamelitensis) 16M 的基因组 DNA 为模板，以 BSR0601-N-F和BSR0601-C-R为引物进行PCR扩增。PCR扩增产物经DNA胶纯化回收试剂盒切胶回收后用Kpn I和Pst I双酶切，与经同样酶双酶切的质粒pRRlMCS-4 (参见文献KovachM, Elzer P,Steven Hill D, et al.Four new derivatives of the broad-host-rangecloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene, 1995，166:175 - 176.)用T4DNA Ligase连接。连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，转化产物涂布氨苄霉素(100μ g/mL)抗性LB平板，对平板上的抗性克隆用引物pBBRl-F和pBBRl-R进行PCR鉴定。扩增出1287bp DNA片段(此DNA片段为含BSR0601的一段DNA片段)的为阳性克隆，将鉴定为阳性的克隆提取质粒，提取的质粒即为过表达载体，将其命名为BSR0601-MCS，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，物理图谱如图3B所示。
[0077](6)BSR0601过表达菌株的筛选
[0078]将过表达载体BSR0601-MCS质粒DNA电转化至16MABSR0601电感受态细胞，涂布含有50 μ g/mL卡那霉素和100 μ g/mL氨苄青霉素的TSA双抗性平板，37°C培养72h以上，筛选双抗性克隆，双抗性克隆即为BSR0601过表达菌株，命名为16M-BSR0601。
[0079](7) 16M Δ BSR0601 和 16M-BSR0601 的 RT-PCR 验证
[0080]为了验证BSR 0601缺失突变株和BSR0601过表达株，可用RT-PCR的方法分析布鲁氏菌16Μ、16Μ Δ BSR0601和16M-BSR0601这三株菌中BSR0601的转录情况，从转录水平对BSR0601缺失突变株和BSR0601过表达株进行验证。将这三株菌在TSB培养基中培养至对数生长中期(0D_=1.2)，然后采用Trizol RNA提取方法抽提总RNA。总RNA用DNAseI消化后，以随机引物为逆转录引物，用M-MLV逆转录酶逆转录成cDNA，反应体系和反应条件为:2μ g的总RNA加上I μ g随机引物，将PCR管于PCR仪中70°C放置lOmin，解开模板中的二级结构；迅速将PCR管置于冰上停留5min以防止二级结构重新形成；短暂离心，将溶液收集到管底；按如下顺序将下列成分加入到引物和模板的混合物中:M_MLV5Xreaction buffer5 μ I,dNTP (2.5mM each) 5 μ I, RNasin? Ribonuclease Inhibitor (40U/ μ I) 25U, M-MLV 逆转录酶(200υ/μ 1)1μ 1，水(无核酸酶)至25 μ I ;轻弹管壁，混合反应液，37°C孵育60min。再以cDNA为模板，用针对BSR0601的引物BSR0601-RT-F和BSR0601-RT-R进行RT-PCR验证，PCR反应体系为:模板Ιμ?，dNTPs (2.5mM each) 2 μ 1，上游引物(20 μ Μ) 0.5 μ 1，下游引物(20 μ Μ) 0.5 μ 1,10XPCR Buffer2.5 μ 1，rTaq(5U/ μ 1)0.125 μ I，无菌去离子水至 25 μ I ；PCR 反应条件为:95°C 5min ；95°C 30s,60°C 30s、72°C 30s, 30 个循环；72°C 7min。
[0081]结果如图4所示，可以看出，布鲁氏菌16Μ、16Μ Λ BSR0601和16M-BSR0601中16sRNA的表达量是相同的，说明这三株菌的cDNA量是一致的。因此，可以进行这三株菌的BSR0601 表达分析。16Μ Δ BSR0601 中没有 BSR0601 的表达，而 16M-BSR0601 中 BSR0601 的表达量高于野生株，实验结果证实BSR0601缺失突变株16Μ Δ BSR0601和BSR0601过表达株16M-BSR0601构建成功。
[0082]2、BSR0601缺失突变株和过表达株在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力分析
[0083]布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，在巨噬细胞的内环境中包含多种杀(抑)菌机制，因此布鲁氏菌必须适应这些机制才能在胞内生存繁殖。为分析BSR0601在布鲁氏菌抵抗和适应这些条件中的作用，可在体外模拟多个胞内条件，包括氧化压力、热休克、酸压力、高渗透压等，分别将布鲁氏菌16M、16MABSR0601、16M-BSR0601在这些条件下进行处理，然后观察它们各自在这些条件作用下的存活率。
[0084]具体实验方法:将培养至对数生长中期(0D_=1.2)的布鲁氏菌16M、16MΔ BSR0601U6M-BSR0601菌液离心，PBS洗I次后将菌体重悬并振荡培养于①含440mMH2O2 的 TSB 液体(40min)中50°C预热的 TSB 液体(60min);③ ρΗ3.0 的 TSB 液体(IOmin);④1.5M的NaCl水溶液(30min) 37°C的TSB液体(40min，对照)等不同的培养基中，倍比稀释后涂布TSA平板进行计数，观察布鲁氏菌16M、16M Δ BSR0601、16M-BSR0601在氧化压力、高盐、热压力、酸压力、高渗透压环境中的存活力。结果以百分比表示，将对照组细菌的生存率设为100%。重复实验3次，计算平均值。
[0085]结果如图5所示，可以看出，与布鲁氏菌野生株16M相比，BSR0601过表达株16M-BSR0601在各种刺激条件下的生存能力明显减弱，结果提示，BSR0601过表达以后，布鲁氏菌在体外刺激条件下的生存能力减弱；与布鲁氏菌野生株16M相比，BSR0601缺失突变株16MABSR0601在氧化、酸和热刺激条件下的生存能力减弱，在渗透压刺激条件下的生存力增强，结果提示，BSR0601缺失以后，布鲁氏菌在体外刺激条件下的生存能力发生变化。实验结果表明，BSR0601的正确表达对于布鲁氏菌在模拟巨卩遼细胞内环境的压力条件下的生存是必需的。因为，选取的刺激条件是模拟巨噬细胞内环境的，因此，BSR0601过表达株在这些刺激条件下的生存率下降，表明BSR0601过表达株在巨噬细胞内的生存能力减弱。
[0086]3.BSR0601缺失突变株和过表达株的小鼠毒力竞争实验
[0087]布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，布鲁氏菌在感染后，首先侵袭的是宿主的局部淋巴结，而后再迁移到其它的器官和组织。脾脏是一种免疫细胞丰富的器官，而布鲁氏菌主要寄生于吞噬细胞，因此脾脏是布鲁氏菌寄居的主要场所之一。布鲁氏菌致病性的重要指标之一是脾脏的载菌数。为了进一步确定BSR0601在布鲁氏菌胞内生存和毒力中的作用，又进行了小鼠毒力竞争实验。`
[0088]按照I X IO5CFU/只的感染剂量免疫小鼠，具体步骤如下:将布鲁氏菌16M、16MΔBSR0601U6M-BSR0601培养至对数生长中期(0D_=1.2)，分为三个组:(1)布鲁氏菌16M与16MABSR0601的混合物(个数比=1:1) ; (2)布鲁氏菌16M与16M-BSR0601的混合物(个数比=1:1) ；(3) PBS阴性对照组。每组细菌的浓度为5X 105CFU/mL，每只小鼠免疫200μ I。在免疫小鼠前，先要分别涂板计数，确认原始的布鲁氏菌野生株16Μ、突变株16MABSR0601、过表达株16M-BSR0601的数量一致。感染后24h时，处死小鼠，无菌条件下迅速取出脾脏，加入ImL含有0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液，用玻璃匀浆器研磨，制成匀浆，将组织匀浆液进行10倍系列稀释，从中选取适当稀释度的匀浆液各100 μ I涂布TSA平板，计算CFU。涂板计数时，要分别涂抗性平板和非抗性平板来进行计数(野生型布鲁氏菌16Μ无抗性、缺失突变株16MABSR0601为卡那抗性、过表达株16M-BSR0601为氨苄抗性)。竞争指数=缺失突变株/野生株或过表达株/野生株。
[0089]结果如图6所示，可以看出，BSR0601过表达株16M-BSR0601与野生株16Μ(16M-BSR0601/16M)的竞争指数为0.3，表明BSR0601过表达株在小鼠体内的生存力明显低于16Μ野生株，也就是说BSR0601过表达时布鲁氏菌的生存力下降、毒力减弱。相反，BSR0601缺失突变株16MABSR0601与野生株16Μ( 16Μ Λ BSR0601/16M)的竞争指数为1.46，表明BSR0601缺失突变株在小鼠体内的生存力高于野生株。因此，有可能BSR0601对靶基因是负调控，当BSR0601缺失时，靶基因表达水平提高，导致布鲁氏菌在小鼠体内生存能力提高； 当BSR0601过表达时，其调控的靶基因表达水平降低，导致小鼠的毒力减弱。小鼠毒力实验结果证实，BSR0601与布鲁氏菌的毒力相关。
【权利要求】
1.来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子(smallnon-coding RNA, sRNA),命名为BSR0601，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，或与序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与布鲁氏菌毒力和生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQ IDNO:1所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述非编码小RNA分子，其特征在于，其与布鲁氏菌毒力和/或生存能力相关。
3.BSR0601缺失突变载体，命名为BSR0601-NC-T，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO:2所示。
4.BSR0601过表达载体，命名为BSR0601-MCS，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
5.以布鲁氏菌(Brucellamelitensis) 16M为出发菌株，构建的转化有权利要求3所述BSR0601缺失突变载体BSR0601-NC-T的布鲁氏菌BSR0601缺失突变株，命名为16MABSR0601。
6.以布鲁氏菌(Brucellamelitensis) 16M为出发菌株,构建的转化有权利要求4所述BSR0601过表达载体BSR0601-MCS的布鲁氏菌BSR0601过表达株，命名为16M-BSR0601。
7.权利要求4所述BSR0601过表达载体在制备抗布鲁氏菌药物中的应用。
8.权利要求6所述过表达株16M-BSR0601在制备抗布鲁氏菌药物中的应用。
9.序列表中SEQID NO:1所示非编码小RNA分子BSR0601在与布鲁氏菌的胞内生存和/或毒力相关的研究试剂或药用产品制备中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述药用产品为抗布鲁氏菌药物。
【文档编号】A61P31/04GK103710345SQ201310741087
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】王玉飞, 陈泽良, 黄留玉, 王立贵, 柯跃华, 杜昕颖, 汪舟佳, 宋宏彬 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所