专利名称：布鲁氏菌GroEL蛋白的应用以及重组表达布鲁氏菌GroEL蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种布鲁氏菌GroEL蛋白的重组表达方法及其作为保护性抗原在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的应用。
背景技术：
布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病(简称布病)是典型的人兽共患传染病，给我国畜牧业生产造成了巨大的经济损失，也严重威胁人民的健康生活，是一个重要的公共卫生问题。 布病是一种慢性传染性疾病，预防该病的发生是控制该病的重要措施。目前，布病的预防主要是通过接种疫苗来实现。灭活和减毒布鲁氏菌病原体制备的疫苗，免疫动物后虽收到了有效免疫应答及免疫保护效果，但存在着接种后强烈过敏反应、免疫与感染难以鉴别诊断以及个别情况下出现菌毒恢复等难题，至今难以给人接种。因此，寻找安全、有效的布病新一代疫苗成为近几年的研究热点。和减毒活疫苗相比，亚单位疫苗具有靶向性、安全性的特点，且其批量制作容易、 费用低，并可解决传统疫苗安全性的问题，另外，亚单位疫苗可在诊断学上区分免疫接种和自然感染。为了发展亚单位疫苗，对保护性抗原的筛选和评价成了最主要的任务。人们陆续对部分布鲁氏菌的表面抗原及胞内蛋白的免疫保护性进行了评价。但到目前为止，仅仅只发现了少数几个具有免疫保护性的蛋白，如L7/L12核糖体蛋白、Cu-^i超氧化物歧化酶蛋白、胞质蛋白P39、31kDa外膜蛋白等。因此，鉴定和筛选新的保护性抗原，将为布鲁氏菌亚单位疫苗的研究奠定基础。前人对于布鲁氏菌GroEL蛋白的研究，以GroEL蛋白与布鲁氏菌胞内生存的关系为主(参考文献 1 Teixeira-Gomes A. P. , Cloeckaert A. , Zygmunt M. S. Characterization of heat, oxidative, and acid stress responses in Brucella melitensis. Infect Immun，2000，68 :2954-2961.参考文献 2 :Lin J.，Ficht T. A. Protein synthesis in Brucella abortus induced during macrophage infection. Infect Immun,1995,63 1409-1414.)。Leclerq S及同事将布鲁氏菌GroEL基因克隆至哺乳系统表达载体构建DNA 疫苗，但是结果显示，该DNA疫苗仅能诱导Thl型免疫应答，却无免疫保护性(Baloglu S.， Toth T. , Schurig G. ,Sriranganathan N. ,Boyle S. Humoral immune response of BALB/ c mice to a vaccinia virus recombinant expressing Brucella abortus GroEL does not correlate with protection against a B. abortus challenge. Vet Microbiol,2000, 76 :193-199.)。对于GroEL重组蛋白的免疫保护性，目前尚无相关研究报道。布鲁氏菌GroEL 蛋白可参考文献 3 (Lin J.，Adams L. G.，Ficht T.A.Characterization of the heat shock response in Brucella abortus and isolation of the genes encoding the GroEL heat shock proteins. Infect Immun, 1992,60 :2425-2431.)的方法获得。
发明内容
本发明的主要目的在于提供布鲁氏菌GroEL蛋白作为保护性抗原在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的新应用。本发明另一目的在于提供了一种高效表达布鲁氏菌GroEL蛋白的方法。该方法是利用Gateway技术使GroEL基因在宿主细胞获得表达，具体包括以下步骤1)构建入门克隆(即BP反应)将GroEL基因和入门载体在(Gateway BP Clonase 酶的作用下进行反应，使GroEL基因克隆进入门载体中，得到入门克隆；2)构建表达克隆载体(即LR反应)将步骤1)构建的包含GroEL基因的入门克隆和目的载体在(Gateway LR Clonase酶的作用下进行反应，使GroEL基因转移进目的载体，得到表达克隆载体；3)将步骤幻构建的表达克隆载体导入宿主细胞，经表达、纯化，得到高活性的布鲁氏菌保护性抗原GroEL。在上述布鲁氏菌保护性抗原GroEL的重组表达方法中，所述步骤1)中的GroEL基因可采用PCR的方法获得，具体包括以下步骤1)先以牛布鲁氏菌的基因组DNA为模板，用5’端含搭桥序列的引物 GroEL-E-F(序列表中序列1)和GroEL-E-R(序列表中序列2)扩增GroEL基因，目的是使 PCR扩增产物带上搭桥序列；2)再以步骤1)的PCR扩增产物为模板，在通用引物attBl(序列表中序列3)和 attB2(序列表中序列4)的引导下进行PCR扩增，目的是使GroEL的PCR扩增产物带上attB 序列，得到GroEL基因。所述步骤1)中的入门载体优选为PD0NR201 ；其中，以pD0NR201为入门载体构建的包含GroEL基因的入门克隆为pENTR-GroEL。所述步骤1)中的1 μ 1反应体系为目的基因扩增纯化产物(lOOng/μ 1)0. 5μ 1、 Gateway BP Clonase酶0· 2 μ 1、入门载体(50ng/μ 1) 0. 3 μ 1 ；反应条件为先在室温下反应4_6h，然后用0. 2μ 1蛋白酶K在37°C下灭活Gateway BP Clonase酶。所述步骤2)中的目的载体优选为pHXGWA ；其中，以pHXGWA为目的载体构建的包含GroEL基因的表达克隆载体为pHXG-GroEL。所述步骤2)中的1 μ 1反应体系为包含GroEL基因的入门克隆(150ng/ μ 1)0. 5 μ 1、目的载体(lOOng/μ 1)0. 3μ 1、Gateway LR Clonase 酶 0· 2 μ 1 ；反应条件为 先在室温下反应4_6h，然后用0. 2μ 1蛋白酶K在37°C下灭活(Gateway BP Clonase酶。所述步骤幻中的宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌；所述大肠杆菌具体可为E. coli ER2566 (DE3)、E. coliBL21 (DE3)、 E.coli BL21(DE3，plysS)，E. coli JM109,E. coli HBlOl 或Ε. coli ToplO 等，优选为 Ε. coli ER2566(DE3)。所述步骤幻中在大肠杆菌宿主细胞进行表达时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG 的浓度为0. 2-1. Ommol/L，优选为0. 5mmol/L，诱导温度为35-39°C，优选为37°C，诱导时间为2-4小时，优选为3小时。所述步骤幻中在大肠杆菌宿主细胞进行表达后还需对表达蛋白进行纯化，其中，用镍-次氮基三乙酸蛋白纯化树脂(Ni-NTA)进行纯化的具体方法为用4-6倍柱体积的细胞裂解液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 20mmol/L imidazole, ρΗ8· 0)平衡 Ni-NTA 凝胶柱过夜，然后取样品上清加入平衡好的Ni-NTA柱中，置于摇床上，4°C结合l_3h，静置， 去上清，再用4-6倍柱体积的洗涤缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 50mmol/L imidazole, pH 8.0)进行洗涤，最后用 60 微升洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl,250mmol/L imidazole, pH 8.0)洗脱目的蛋白，收集洗脱后的样品，得到纯化的布鲁氏菌GroEL蛋白(布鲁氏菌保护性抗原GroEL)。用本发明方法表达的布鲁氏菌GroEL蛋白即布鲁氏菌保护性抗原GroEL也属于本发明的保护范围。实验证明，布鲁氏菌GroEL蛋白具有免疫保护性，可作为保护性抗原用于制备布鲁氏菌亚单位疫苗。需要的时候，以布鲁氏菌GroEL蛋白为保护性抗原制备的布鲁氏菌亚单位疫苗中还可以融入免疫佐剂，包括弗式佐剂、微生物佐剂及其产物(常用的微生物有分枝杆菌、 短小棒状杆菌、百日咳杆菌以及处左兰氏阴性杆菌的提取物脂多糖，自分枝杆菌的提取物质胞壁酰二肽等)、多聚核苷酸佐剂(如多聚肌苷酸胞苷酸(polyl C)，多聚腺苷酸 (polyl A μ)等)、无机物佐剂(如明矾及氢化铝等)、以及颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ (0^-^)、白介素2(11^-2)36 -0 4等一种或多种细胞因子作为分子免疫佐剂。本发明的疫苗可以制成注射液、微球体、干粉针剂或气雾剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。上述亚单位疫苗的用量可采用药学领域中亚单位疫苗的常规剂量，并可根据实际情况调整。本发明试验中对布鲁氏菌GroEL蛋白的免疫原性和免疫保护性进行了分析。实验结果表明布鲁氏菌GroEL蛋白可在体外明显刺激S19免疫小鼠的脾细胞分泌IFN-γ， 说明GroEL蛋白可刺激T细胞免疫反应。将GroEL重组蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠，观测其体液免疫和细胞免疫能力，结果显示免疫小鼠可以刺激机体产生布鲁氏菌特异的IgG抗体，并以IgGh亚型为主，这说明GroEL和佐剂混合免疫可以刺激机体产生体液免疫反应。 由于布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，细胞免疫反应在机体抵御布鲁氏菌的侵染中起着主要作用，尤其是Thl型细胞免疫因子IFN-Y在体内外的抗菌作用中发挥了重要作用；为了评价 GroEL重组蛋白的细胞免疫能力，在体外用纯化的GroEL蛋白刺激GroEL重组蛋白联合佐剂免疫小鼠的脾细胞，并测定了脾细胞的IFN-Y分泌量；结果显示GroEL蛋白免疫小鼠脾细胞分泌的IFN- γ量远远高于PBS组；这表明GroEL和佐剂混合免疫可以刺激机体产生Thl 细胞免疫反应；而IgGh的抗体含量明显高于IgGl也再次证实了这一点。为了评价GroEL 重组蛋白的免疫保护性，对GroEL和佐剂联合免疫小鼠进行了攻毒实验；结果显示GroEL和佐剂联合免疫小鼠的免疫保护性明显高于用PBS对照组，与已知保护性较好的L7/L12阳性对照组具有相同的免疫保护力(1.35个单位)，且两组都明显高于S19免疫组(0.92个单位)。综上所述，布鲁氏菌GroEL蛋白和弗氏佐剂联合免疫可诱导产生特异性的抗体，激发细胞免疫，并对布鲁氏菌具有较好的免疫保护效果，可用于制备布鲁氏菌亚单位疫苗。本发明将在布鲁氏菌的防疫中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为利用Gateway技术进行GroEL蛋白表达、纯化的SDS-PAGE检测结果图2A为IFN- γ试剂盒测定的标准曲线图2Β为GroEL蛋白刺激S19免疫小鼠及PBS免疫小鼠产生的IFN- γ的含量图3Α为GroEL蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体水平图;3Β为GroEL蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体的抗体分型图4为GroEL蛋白诱导GroEL蛋白免疫小鼠脾细胞分泌的IFN- γ量
具体实施例方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、重组表达布鲁氏菌GroEL蛋白本实施例中利用(Gateway技术使布鲁氏菌保护性抗原GroEL基因在大肠杆菌中获得表达获得布鲁氏菌GroEL蛋白。应该理解，该实施例仅用于清楚说明获得布鲁氏菌GroEL 蛋白的一种方式，布鲁氏菌GroEL蛋白的获得并不排除以其他文献(例如背景技术中提到的文献3)介绍的方式制备得到，也可以从可能的商业渠道获得。一、PCR扩增布鲁氏菌保护性抗原GroEL基因1、引物设计采用I^rimer 5. O软件设计扩增GroEL基因(BMEII1048)和作为阳性对照的L7/ L12基因(BMEI0748)的引物，并在每对引物的5’端分别引入相应的搭桥序列，上游为 5，-AAAAAGCAGGCTTA-3 ’，下游为 5 ’ -TGTACAAGAAAGCTGGGTC-3 ’，同时设计一对通用引物 attBl和attB2，引物序列见表1，由北京奥科生物公司合成。表1引物序列
引物名称序列(5，-3’ )GroEL-E-FGTACA^^^^mGCTGCAAAAGACGTAAAATTCG (序列表中序列 1)GroEL-E-RTGTACAAGAAAGCrGGGraTCGGCGATCATTGCTTC (序列表中序列2)L7/L12-E-FGTACA^^^^mCTCGCAAAGATCGTTGAAGACL7/L12-E-RTGTACAAGAAAGCrGGGrOOTTGAGTTCAACCTTGGCattBlGGGGACAAGTTTGTACAAMAAGCAGGCT (序列表中序列 3 )attB2GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT (序列表中序列4)2、PCR 扩增分两步扩增GroEL基因和作为阳性对照的L7/L12基因第一步以牛布鲁氏菌强毒株B. abortus M4 (国家⑶C提供)的基因组DNA为模板，用含搭桥序列的引物GroEL-E-F和GroEL-E-R扩增GroEL基因，用含搭桥序列的引物L7/L12-E-F和L7/L12-E-R扩增L7/L12基因。PCR扩增体系为基因组DNA (20ng/ μ 1)0. 5 μ 1, Taq polymerase (5U/μ 1) 1U, IOXPCR Buffer 5 μ 1, dNTP(2. 5mM) 4 μ 1, GroEL-E-F (20 μ Μ) 0. 5 μ 1，GroEL-E-R (20 μ Μ) 0. 5 μ 1,补充无菌水至 50 μ 1。PCR 扩增条件为先 94°C 5min ；然后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 2min,共 10 个循环；最后 72°C 7min。第二步以第一步的PCR扩增产物10 μ L为模板，用通用引物attBl和attB2进行第二步扩增。PCR扩增体系为第一步的PCR扩增产物10 μ 1，Taq polymerase (5U/μ 1) 1U, 10 X PCR Buffer 4 μ 1，dNTP (2. 5mM) 4 μ 1，attBl (20 μ Μ) 2 μ 1，attB2 (20 μ Μ) 2 μ 1，补充无菌水至 50 μ 1。PCR 扩增条件先 94°C 5min ；然后 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 2min，共 30 个循环；最后 72 °C 7min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果获得了 1641bp的GroEL基因条带和36;3bp的L7/L12基因条带，与预期结果相符，用DNA回收试剂盒(购自天根公司)对目的基因进行回收及纯化。二、Gateway技术构建表达载体1、构建入门克隆(即BP反应)用购自hvitrogen公司的(Gateway BP反应试剂盒将GroEL基因(或阳性对照L7/L12基因)和入门载体在(Gateway BP Clonase酶的作用下进行反应，使GroEL基因(或阳性对照L7/L12基因)克隆进入门载体中，得到入门克隆，1 μ 1反应体系为目的基因扩增纯化产物(lOOng/μ 1)0. 5μ 1、GatewayBP Clonase酶 0. 2μ 1、入门载体pD0NR201(购自Invitrogen公司，50ng/μ 1) 0. 3 μ 1。反应条件为室温作用4_6h，然后用0. 2μ 1蛋白酶K在37°C下作用IOmin灭活(Gateway BP Clonase酶。反应结束后，将反应产物转化40 μ 1大肠杆菌DH5 α化学感受态细胞，加150 μ 1 LB液体培养基复苏45min，涂含50 μ g/mL Kan的抗性平板。每个平板随机挑取3_6个菌落用相应引物进行PCR鉴定，鉴定结果表明获得了序列正确的入门克隆，分别命名为pENTR-GroEL和 PENTR-L7/L12。2、构建表达克隆载体(即LR反应)用购自hvitrogen公司的(Gateway LR反应试剂盒将步骤1构建的包含GroEL基因(或阳性对照L7/L12基因)的入门克隆和目的载体在 Gateway LR Clonase酶的作用下进行反应，使GroEL基因(或阳性对照L7/L12基因)转移进目的载体，得到表达克隆载体，Ιμ 反应体系为含目的基因的入门克隆(pENTR-GroEL 或 pENTR-L7/L12,150ng/y 1)0. 5 μ 1、目的载体 pHXGWA (购自 Invitrogen 公司，IOOng/ μ 1)0. 3 μ 1、Gateway LR Clonase酶0· 2 μ 1。反应总体积为先室温作用4_6h，然后用 0. 2μ 1蛋白酶K在37°C下作用IOmin灭活(Gateway LR Clonase酶。反应结束后，将反应产物转化到40 μ 1大肠杆菌ER2566 (DE3)(购自New England Biolabs公司)化学感受态细胞中，加150 μ 1 LB液体培养基复苏30min，涂含100 μ g/mL Amp的抗性平板。每个平板随机挑取3-6个菌落用相应引物进行PCR鉴定，鉴定结果表明获得了序列正确的表达克隆载体，分别命名为pHXG-GroEL和pHXG-L7/L 12。三、目的蛋白的诱导表达、纯化1、目的蛋白的诱导表达挑取步骤二获得的携带pHXG-GroEL (或阳性对照pHXG_L7/L12LR)的LR阳性单克隆菌接入含100 μ g/mL Amp抗性的LB培养基中，用0. 5mmol/L的IPTG在37°C下诱导表达3小时，同时设阴性对照(未诱导表达)。表达结束后，超声处理表达菌株，分别收集上清和沉淀进行12% SDS-PAGE检测。携带pHXG-GroEL的LR阳性单克隆菌的表达结果如图1所示(1.蛋白Maker ;2.未诱导的蛋白；3.诱导后的蛋白；4.超声液上清；5.超声液沉淀)， 与未诱导的蛋白相比，诱导后的目的蛋白GroEL在72. 02KDa处有一条明显的条带，此外， GroEL蛋白同时以可溶性和包涵体形式表达。取上清进行蛋白纯化。检测结果表明阳性对照L7/L12也获得了表达。2、目的蛋白的纯化用镍-次氮基三乙酸蛋白纯化树脂(Ni-NTA，购自Novagen公司)对目的蛋白进行纯化，具体方法为用5倍柱体积的细胞裂解液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/LNaCl, 20mmol/L imidazole, pH8. 0)平衡Ni-NTA凝胶柱过夜，然后取样品上清加入平衡好的Ni-NTA柱中，置于摇床上，4°C结合2h，静置，去上清，再用5倍柱体积的洗涤缓冲液 (50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 50mmol/L imidazole,pH8. 0)进行洗涤，最后用 60 微升洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 250mmol/L imidazole,pH 8· 0)洗脱目的蛋白，收集洗脱后的样品。纯化后将蛋白溶解在PBS中，用12% SDS-PAGE蛋白电泳进行纯化后的验证，结果如图1所示(6.纯化后的蛋白)，结果获得经纯化的目的蛋白GroEL(布鲁氏菌GroEL蛋白)，用核酸蛋白微量定量仪(Nanodrop)测定蛋白浓度，浓度为0. 5mg/ml。 用同样方法对阳性对照L7/L12也进行了纯化。实施例2、布鲁氏菌GroEL蛋白免疫原性和免疫保护性验证下述实验使用实施例1得到的布鲁氏菌GroEL蛋白进行，但本领域技术人员都了解，该实验结论同样适用于其他途径(如文献介绍或商业购买)得到的布鲁氏菌GroEL蛋白(任何具有活性的布鲁氏菌GroEL蛋白)。试验一、小鼠免疫、脾细胞刺激和IFN-Y测定由于布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，细胞介导的免疫反应在机体抵御布鲁氏菌的侵入中起着重要作用。为鉴定GroEL是否为布鲁氏菌的候选保护性蛋白，首先对GroEL的T 细胞反应性进行了验证。试验方法将6-8周龄雌性BALB/C小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为两组，每组5只，一组用布鲁氏菌疫苗株S19(国家CDC提供)进行腹膜内免疫(IXlO5CFU/只)，另一组免疫PBS作为阴性对照。35天后，处死小鼠，无菌取脾，以200目铜网研磨，分离单个脾细胞。将分离的脾细胞IOOOrpm离心lOmin，并用IOmL 的红细胞裂解液(150mM NH4Cl, ImM KHCO3,0. ImMNa2EDTA [pH7. 3])避光裂解 15min，PBS 洗涤 2次后以1640完全培养基将脾细胞数量调整至5 X IO5细胞/孔。用目的蛋白GroEL (1 μ g/ 孔)、0. 5 μ g ConA (阳性对照)和1640培养基(阴性对照)分别刺激脾细胞，37°C培养箱孵育7 后，取细胞上清，用R&D System公司的Mouse IFN-γ免疫分析试剂盒测定细胞因子IFN- γ的含量。实验重复3次。结果如图2Α和图2Β所示(图2Α =IFN-γ试剂盒测定的标准曲线；图2Β =GroEL蛋白刺激S19免疫小鼠和PBS免疫小鼠产生的IFN- γ的含量)，和阴性对照PBS组相比，S19 免疫的小鼠脾细胞可以产生更高的IFN- Y (P < 0. 001)，这表明GroEL蛋白可以诱导S19免疫小鼠脾细胞产生T细胞反应。试验二、小鼠免疫、攻毒实验及细胞因子反应UGroEL蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体水平及抗体分型
利用ELISA方法测定GroEL免疫小鼠在不同时间点的血清IgG抗体水平，同时以已经报道保护性抗原L7/L12(BMEI0748)蛋白作为阳性对照。免疫方案将6_8周龄雌性 BALB/C小鼠随机分组，每组10只。第1天以30 μ g纯化蛋白+弗氏完全佐剂乳化后腹膜内注射免疫，第15天以同样量的蛋白+弗氏不完全佐剂乳化加强免疫一次。S19(lX105cfu/ 只)+弗氏不完全佐剂作为阳性对照，初免后15天腹膜内注射免疫。PBS组为阴性对照，免疫方式同蛋白。然后，分别于免疫后的第0、15、30、45、60和75天小鼠尾静脉取血，通过间接ELISA反应来测定小鼠血清中的IgG效价，具体方法为将纯化蛋白用包被液(pH 9.6) 稀释成5 μ g/ml，然后将稀释好的蛋白(100 μ 1/孔)4°C包被过夜，洗板，封闭；将稀释好的小鼠血清加入到酶联板中，孵育后洗板，加入兔抗鼠的辣根过氧化物酶标二抗(50μ 1/孔) 孵育30分钟后，洗板；每孔加入100 μ 1显色液(200 μ mol邻苯二胺和0. 04% H2O2)显色20 分钟；终止液(2M硫酸溶液)终止反应后，酶标仪测定450nm处的吸光度值。所有的分析测定重复3次。测定S19疫苗株免疫小鼠的抗体效价时用热灭活的S19菌株包被。结果如图3A所示(图3A =GroEL免疫小鼠在不同时间点的血清IgG抗体水平)， GroEL蛋白可以诱导小鼠产生特异性抗体，在一免后30天，IgG的平均滴度为2000，在45天时抗体水平达到最高(IgG平均滴度为8540)。同时还用间接ELISA反应对小鼠血清抗体水平最高时的抗体进行了抗体分型鉴定，检测了与Thl相关的IgGh亚型和与Th2相关的IgGl亚型的比例。结果如图:3B所示 (图3B =GroEL免疫小鼠产生的血清IgG抗体分型)，IgGl的抗体滴度低于IgGh抗体滴度， 说明GroEL主要刺激机体产生Thl型免疫反应。2、攻毒实验初次免疫后的45天，对免疫小鼠进行攻毒实验，通过计算小鼠脾脏内布鲁氏菌的CFU来评价GroEL的保护性效果。试验方法腹膜内注射2X IO4CFU布鲁氏菌强毒株 B. abortus 544 攻毒后30天，处死小鼠，无菌取脾，用含有0. 1 % Triton X-100的PBS研磨脾脏，研磨液系列稀释后取100 μ 1涂TSA平板，37°C培养5天后进行菌落计数。结果如表2所示，与PBS组相比，GroEL免疫组具有明显的保护性(P <0.01)，其免疫保护力与已知保护性较好的L7/L12阳性对照组具有相同的免疫保护力(1. 35个单位)， 且两组都明显高于S19免疫组(0. 92个单位)。这些结果显示GroEL蛋白对布鲁氏菌感染具有免疫保护性。表2GroEL蛋白的免疫保护性实验结果
权利要求
1.布鲁氏菌GroEL蛋白作为保护性抗原在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的应用。
2.一种布鲁氏菌亚单位疫苗，以布鲁氏菌GroEL蛋白作为保护性抗原制备得到。
3.根据权利要求2所述布鲁氏菌亚单位疫苗，其特征在于，还包括免疫佐剂，包括但不限于弗式佐剂、微生物佐剂及其产物(如分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌以及处左兰氏阴性杆菌的提取物脂多糖，自分枝杆菌的提取物质胞壁酰二肽等)、多聚核苷酸佐剂(如多聚肌苷酸胞苷酸(polyl C)，多聚腺苷酸(polyl A μ)等)、无机物佐剂(如明矾及氢化铝等)、以及分子免疫佐剂(如颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-Y (IFN- Y )、白介素2 (IL-2)、TGF- β 4等一种或多种细胞因子)。
4.一种重组表达布鲁氏菌保护性抗原GroEL的方法，是利用Gateway技术使GroEL基因在宿主细胞获得表达，具体包括以下步骤1)构建入门克隆(即BP反应)将GroEL基因和入门载体在(GatewayBP Clonase 酶的作用下进行反应，使GroEL基因克隆进入门载体中，得到入门克隆；所述入门载体为 PD0NR201 ；以pD0NR201为入门载体构建的包含GroEL基因的入门克隆为pENTR-GroEL ；2)构建表达克隆载体(即LR反应)将步骤1)构建的包含GroEL基因的入门克隆和目的载体在(Gateway LR Clonase酶的作用下进行反应，使GroEL基因转移进目的载体，得到表达克隆载体；所述步骤目的载体为PHXGWA ；以pHXGWA为目的载体构建的包含GroEL基因的表达克隆载体为pHXG-GroEL。3)将步骤幻构建的表达克隆载体导入宿主细胞，经表达、纯化，得到高活性的布鲁氏菌GroEL蛋白即布鲁氏菌保护性抗原GroEL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤1)中的GroEL基因采用PCR的方法获得，具体方法包括以下步骤(1)先以牛布鲁氏菌的基因组DNA为模板，用5’端含搭桥序列的引物GroEL-E-F(序列表中序列1)和GroEL-E-R(序列表中序列2)扩增GroEL基因；(2)再以步骤1)的PCR扩增产物为模板，在通用引物attBl(序列表中序列3)和 attB2 (序列表中序列4)的引导下进行PCR扩增，得到GroEL基因。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤1)中的Iyl反应体系为目的基因扩增纯化产物(lOOng/μ 1)0. 5 μ 1、Gateway BP Clonase 酶 0· 2 μ 1、入门载体(50ng/ μ 1)0. 3μ 1 ；反应条件为先在室温下反应4-他，然后用0.2μ 1蛋白酶K在37°C下灭活 Gateway BP Clonase 酶。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的Iyl反应体系为包含 GroEL 基因的入门克隆(150ng/y 1)0. 5μ 1、目的载体(IOOng/μ 1) 0. 3 μ 1、Gateway LR Clonase酶0. 2 μ 1 ；反应条件为先在室温下反应4_6h，然后用0. 2 μ 1蛋白酶K在37°C下灭活 Gateway BP Clonase 酶。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤幻中的宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌，优选为大肠杆菌；所述大肠杆菌具体可为E. coli ER2566(DE3)、E. coli BL21 (DE3)、Ε. coli BL21 (DE3, plysS), Ε. coliJM109, Ε. coli HBlOl 或Ε. coli ToplO，优选为Ε. coli ER2566 (DE3)；所述步骤；3)中在大肠杆菌宿主细胞进行表达时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0. 2-1. Ommol/L，优选为0. 5mmol/L，诱导温度为35-39°C，优选为37°C，诱导时间为2_4小时，优选为3小时。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于所述步骤幻中在大肠杆菌宿主细胞进行表达后还需对表达蛋白进行纯化，其中，用镍-次氮基三乙酸蛋白纯化树脂(Ni-NTA)进行纯化的具体方法为用4-6倍柱体积的细胞裂解液(50mmOl/LNaH2P04， 300mmol/L NaCl, 20mmol/L imidazole, pH8. 0)平衡 Ni-NTA 凝胶柱过夜，然后取样品上清加入平衡好的Ni-NTA柱中，置于摇床上，4°C结合l_3h，静置，去上清，再用4-6倍柱体积的洗涤缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 50mmol/Limidazole, pH 8.0)进行洗涤， 最后用 60 微升洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 250mmol/L imidazole,pH 8. 0)洗脱目的蛋白，收集洗脱后的样品，得到纯化的布鲁氏菌保护性抗原GroEL。
10.用权利要求4-9任一项所述方法表达得到的布鲁氏菌保护性抗原GroEL。
全文摘要
本发明布鲁氏菌GroEL蛋白的应用以及重组表达布鲁氏菌GroEL蛋白的方法，公开了布鲁氏菌GroEL蛋白作为保护性抗原在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的应用以及一种重组表达布鲁氏菌保护性抗原GroEL的过程。实验证明布鲁氏菌GroEL蛋白和佐剂联合免疫可诱导产生特异性的抗体，激发细胞免疫，并对布鲁氏菌具有较好的免疫保护效果，可用于制备布鲁氏菌亚单位疫苗。本发明将在布鲁氏菌的防疫中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C07K14/23GK102198269SQ201110092479
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月13日 优先权日2011年4月13日
发明者付思美, 宋宏彬, 徐杰, 杜昕颖, 汪舟佳, 王玉飞, 袁静, 陈泽良, 黄留玉 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所