专利名称：从鹿蹄草中分离纯化高熊果酚苷、金丝桃苷的方法
技术领域：
本发明涉及从植物中分离纯化功能性成分的方法，具体是从鹿蹄草全株中分离纯化高熊果酚苷和金丝桃苷。
背景技术：
鹿蹄草(P. calliantha H Andr)为鹿蹄草科多年生常绿草本植物。又名鹿衔草、鹿寿草、破血丹等，主要分布在我国东北、西南以及东南等地，是一种民间常用中草药。鹿蹄草具有补虚、益肾、活血、补气补血、止血、强筋骨、利尿、抑菌等功效；用于治虚弱痨病、咳嗽、盗汗、遗精、腰膝无力白带、补肾壮阳、调经活血；治外伤出血、虫蛇犬咬伤，过敏性皮炎、疮痈肿毒；治慢性风湿性关节炎、类风湿性关节炎、半身不遂、筋骨酸软；治慢性肠炎、痢疾等症。本品的水煎剂，具有抑菌作用，对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌及绿脓肝菌等均有抑制作用。现在已知的鹿蹄草中活性成分包括，熊果甙、高熊果甙、高熊果酚苷、肾叶鹿蹄草苷、羟基肾叶鹿蹄草苷、熊果酸、梅笠草素、鹿蹄草素、2" -O-没食子酰基金丝桃苷、金丝桃苷、槲皮素、异槲皮素、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸和β -谷留醇等成分。此次从鹿蹄草中分离得到的高熊果酚苷和金丝桃苷的含量较高并且活性突出。金丝桃苷是一种黄酮的醇苷，其药理活性，有保肝、抗过敏、抗炎、解痉、降压、抗乙肝病毒和显著止咳等作用，特别是具有镇痛及对心脑血管的保护功能，是目前研究最多的也是最突出的生理活性和药理作用。近年来，随着威胁人类健康的两大杀手心血管和脑血管疾病的日益猖獗，人们对这两种疾病的重视程度日益增加，对治疗的药物也倍加关注。金丝桃苷具有对脑缺血再灌伤有显著的保护作用、还具有对抗缺氧-再给氧导致心肌细胞损伤的作用以及抗心肌脂质过氧化等作用。它的镇痛作用强于阿司匹林，弱于吗啡，且没有依赖性，被称为“第三类镇痛药”，是一种新型镇痛药。近年来的研究表明，金丝桃苷具有增强免疫功能和抗抑郁的新功效。高熊果酚苷是一种多酚的糖苷，经研究表明他可以选择性抑制小鼠咳嗽中枢，有镇咳的作用。现有制备金丝桃苷的方法，如申请的公开号为CN1493578的中国专利，以干燥的黄蜀葵花粉为原料，用亲水溶剂提取，聚酰胺柱层析，真空干燥等工艺制成。此法因聚酰胺柱每次层析后需要再生，且死吸附较严重，故该法相对成本高，耗时长，损失大。如申请的公开号为CN1880328的中国专利，以贯叶连翘为原料，经繁杂的工艺制成。如申请的公开号为CN101260133的中国专利，以棉花为原料，在提取过程中应用了大量的毒性较大的有机溶剂，不利于健康生产。现有的报道中未见有制备高熊果酚苷的方法，而在我们的研究中得知，它是一种活性很突出的酚类化合物，它的用途有待进一步开发。综上所述，在利用植物提取物分离纯化高熊果酚苷和金丝桃苷的过程中，主要的影响因素在于分离过程中普遍存在耗时长，目的化合物流失大，使得成本升高。因此，有必要寻找一种简便安全经济高效地分离纯化高熊果酚苷和金丝桃苷的方法。本发明旨在建立一种通过多种现代分离纯化技术手段相结合的方法，实现简单快速、损失少且绿色环保的分离纯化高熊果酚苷和金丝桃苷的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供以鹿蹄草全株为原料，通过超声波辅助提取技术、大孔吸附树脂富集技术、Sephadex LH-20凝胶柱层析分离技术、ODS-C18反相中压硅胶柱层析分离技术以及低温析晶和重结晶技术，从而大量、快速获得高熊果酚苷和金丝桃苷单体，该方法简单易行、目标化合物损失少。本发明的目的是通过以下方案来达到的全株粉碎的鹿蹄草，经70 90%乙醇热回流或超声波辅助提取，提取液浓缩后经大孔吸附树脂富集、Sephadex LH-20型凝胶柱层析和ODS-C18反相中压硅胶柱层析分离纯化后，得到纯度为82-87%的高熊果酚苷和金丝桃苷的产品，再经过低温析晶和重结晶得到 纯度大于95%的纯品。上述高熊果酚苷和金丝桃苷分离纯化的方法，其特征在于，取一定量的粉碎的鹿蹄草全株，进行热回流或超声波辅助提取，每克鹿蹄草全株粉末加入10 20ml的70 90%乙醇，提取时间为40 50min，温度40 75 °C，其中，超声波辅助提取功率为32 40KHz，每次过滤后将固体重复提取过程，此过程重复至少2次。合并提取液，减压浓缩至密度为I. 12-1. 20。将提取浓缩所得的固形物用水配制成料液浓度为10 30mg/ml的混悬药液，大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将混悬的药液通过吸附柱，上样量0. 5 I. 5倍柱体积，先用2倍柱体积的水洗杂质，再依次用4 6倍柱体积，乙醇浓度分别为10%、30^^50%和70%的溶剂系统进行梯度洗脱解吸，洗脱流速为5 10ml/min，分别收集各梯度的洗脱液，合并乙醇浓度30 50%部位的洗脱液，将合并的洗脱液在不超过60°C条件下减压浓缩至无明显液体流出。将大孔吸附树脂富集浓缩的产物用15 20%甲醇溶解，配制成料液浓度为5 20mg/mL的样品液,经0. 45 y m滤膜过滤后，按照100 150mg样品/ml凝胶,注入SephadexLH-20凝胶柱，用水-甲醇体系洗脱，先用20%甲醇2 5倍柱体积洗脱、然后用40%甲醇3 7倍柱体积洗杂质、最后用60%甲醇4 7倍柱体积洗脱，收集洗脱液,每份1/5 1/2倍柱体积通过TLC薄层硅胶色谱指导，展开剂为三氯甲烷甲醇甲酸=5 : 4 : I 5:1: 1，紫外波长为254nm和360nm，对洗脱液中含有相同成分的部分进行合并，分别进行减压浓缩，20%部分得到化合物I粗品。将凝胶S印hadex LH-20柱层析分离合并后得到60%部分用2 8%甲醇溶解，配制成料液浓度为5 10mg/mL，上样量0. I 0. 5倍柱体积，0. 45 u m滤膜过滤后注入柱体积为50 150ml的ODS-C18反相中压硅胶柱，用水-甲醇体系梯度洗脱，先用10%甲醇2 5倍柱体积洗杂质、然后用30%甲醇3 7倍柱体积洗脱，收集洗脱液,每份1/4 1/2倍柱体积，通过TLC薄层色谱指导，展开剂为三氯甲烷甲醇甲酸=5 : 4 : I 5 : I : 1，紫外波长为254nm和360nm，对洗脱液中含有相同成分的部分进行合并，得到化合物II粗品。经过低温析晶得到产品，重结晶后得到纯品。上述的鹿蹄草中高熊果酚苷、金丝桃苷的分离纯化方法所用的大孔吸附树脂为AB-8、NKA-9 或 DlOl 型。上述的低温析晶和重结晶技术，其特征在于重结晶所用的溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷中的一种和甲醇、丙酮、乙腈或乙醇中的一种，以15 : I到I : I的比例混合，低温析晶温度为-10°C 10°C。本发明的优点I.该方法简单易行，周期短。2.产品得率高、纯度高。3.分离柱可反复使用，具有良好的重复性。
图I为高熊果酚苷的结构图2为金丝桃苷的结构
具体实施方案实施例I称取500g粉碎的鹿蹄草全株，加入10倍体积的85%乙醇后，进行超声波辅助提取，提取时间40min，温度40 50°C，功率36KHz，提取后将提取液抽滤出来，在重复以上过程2次，合并三次提取液，减压浓缩至密度为I. 15。将提取浓缩所得的固形物89. 3g用水配制成料液浓度为15mg/ml的混悬药液,上样量O. 6倍柱体积，以洗脱流速7ml/min条件下过AB-8型大孔吸附树脂，吸附后先用2倍柱体积的水洗杂质，再依次用6倍柱体积，乙醇浓度分别为10^^30^^50%和70%的溶剂系统进行梯度洗脱解吸，分别收集各梯度的洗脱液，合并乙醇浓度30 50%部位的洗脱液，将合并的洗脱液在50°C条件下减压浓缩至无明显液体流出。将大孔吸附树脂富集浓缩的产物39. 3g，用15%甲醇溶解，配制成料液浓度为10mg/mL的样品液,经O. 45μηι滤膜过滤后，按照IOOmg样品/ml凝胶,注入Sephadex LH-20凝胶柱，用水-甲醇体系洗脱，先用3倍柱体积的20%甲醇洗脱、然后用5倍柱体积的40%甲醇洗杂质、最后用5倍柱体积的60%甲醇洗脱，收集洗脱液，每份1/4倍柱体积通过TLC薄层硅胶色谱指导，展开剂为三氯甲烷甲醇甲酸=5 2 1，紫外波长为254nm和360nm，对洗脱液中含有相同成分的部分进行合并，分别进行减压浓缩，20%部分得到化合物I粗品。将凝胶S印hadex LH-20柱层析分离合并后得到60 %部分用6 %甲醇溶解，配制成料液浓度为5mg/mL，上样量O. 2倍柱体积，O. 45 μ m滤膜过滤后注入柱体积为IOOml的ODS-C18反相中压硅胶柱，用水-甲醇体系梯度洗脱，先用3倍柱体积的10%甲醇洗杂质、然后用5倍柱体积的30%甲醇洗脱，收集洗脱液，每份1/3倍柱体积，通过TLC薄层色谱指导，展开剂为三氯甲烷甲醇甲酸=5 I 1，紫外波长为254nm和360nm，对洗脱液中含有相同成分的部分进行合并，得到化合物II粗品。经过低温析晶得到，化合物I为高熊果酚苷，50. 26mg，纯度为97%。化合物II为金丝桃苷，41. 33mg，纯度为95%。实施例2称取300g粉碎的鹿蹄草全株，加入15倍体积的75%乙醇后，进行超声波辅助提取，提取时间50min，温度40 50°C，功率32KHz，提取后将提取液抽滤出来，在重复以上过程2次，合并三次提取液，减压浓缩至密度为I. 20。将提取浓缩所得的固形物57. Ig用水配制成料液浓度为20mg/ml的混悬药液,上样量0. 8倍柱体积，以洗脱流速8ml/min条件下过NKA-9型大孔吸附树脂，吸附后先用2倍柱体积的水洗杂质，再依次用5倍柱体积，乙醇浓度分别为10^^30^^50%和70%的溶剂系统进行梯度洗脱解吸，分别收集各梯度的洗脱液，合并乙醇浓度30 50%部位的洗脱液，将合并的洗脱液在55°C条件下减压浓缩至无明显液体流出。将大孔吸附树脂富集浓缩的产物24. 6g，用10%甲醇溶解，配制成料液浓度为15mg/mL的样品液,经0. 45 u m滤膜过滤后，按照120mg样品/ml凝胶,注入Sephadex LH-20凝胶柱，用水-甲醇体系洗脱，先用3倍柱体积的20%甲醇洗脱、然后用6倍柱体积的40%甲醇洗杂质、最后用7倍柱体积的60%甲醇洗脱，收集洗脱液，每份1/5倍柱体积通过TLC薄层硅胶色谱指导，展开剂为三氯甲烷甲醇甲酸=5 3 1，紫外波长为254nm和360nm，对洗脱液中含有相同成分的部分进行合并，分别进行减压浓缩，20%部分得到化合物I粗品。将凝胶S印hadex LH-20柱层析分离合并后得到60 %部分用5 %甲醇溶解，配制 成料液浓度为6mg/mL，上样量0. 2倍柱体积，0. 45 u m滤膜过滤后注入柱体积为IOOml的ODS-C18反相中压硅胶柱，用水-甲醇体系梯度洗脱，先用4倍柱体积的10 %甲醇洗杂质、然后用6倍柱体积的30%甲醇洗脱，收集洗脱液，每份1/4倍柱体积，通过TLC薄层色谱指导，展开剂为三氯甲烷甲醇甲酸=5 2 1，紫外波长为254nm和360nm，对洗脱液中含有相同成分的部分进行合并，得到化合物II粗品。经过低温析晶得到，化合物I为高熊果酚苷，29. 87mg,纯度为97%。化合物II为金丝桃苷，25. 62mg,纯度为96%。实施例3称取IOOOg粉碎的鹿蹄草全株，加入12倍体积的70%乙醇后，进行热回流提取，提取时间50min，温度75°C，提取后将提取液抽滤出来，在重复以上过程2次，合并三次提取液，减压浓缩至密度为I. 20。将提取浓缩所得的固形物182. 4g用水配制成料液浓度为25mg/ml的混悬药液,上样量I倍柱体积，以洗脱流速10ml/min条件下过DlOl型大孔吸附树脂，吸附后先用2倍柱体积的水洗杂质，再依次用6倍柱体积，乙醇浓度分别为10%、30 %、50 %和70 %的溶剂系统进行梯度洗脱解吸，分别收集各梯度的洗脱液，合并乙醇浓度
30 50%部位的洗脱液，将合并的洗脱液在60°C条件下减压浓缩至无明显液体流出。将大孔吸附树脂富集浓缩的产物82. lg，用10%甲醇溶解，配制成料液浓度为20mg/mL的样品液,经0. 45 u m滤膜过滤后，按照150mg样品/ml凝胶,注入Sephadex LH-20凝胶柱，用水-甲醇体系洗脱，先用5倍柱体积的20%甲醇洗脱、然后用5倍柱体积的40%甲醇洗杂质、最后用6倍柱体积的60%甲醇洗脱，收集洗脱液，每份1/2倍柱体积通过TLC薄层硅胶色谱指导，展开剂为三氯甲烷甲醇甲酸=5 2 1，紫外波长为254nm和360nm，对洗脱液中含有相同成分的部分进行合并，分别进行减压浓缩，20%部分得到化合物I粗品。将凝胶S印hadex LH-20柱层析分离合并后得到60 %部分用8 %甲醇溶解，配制成料液浓度为10mg/mL，上样量0. 5倍柱体积，0. 45 u m滤膜过滤后注入柱体积为150ml的ODS-C18反相中压硅胶柱，用水-甲醇体系梯度洗脱，先用5倍柱体积的10%甲醇洗杂质、然后用7倍柱体积的30%甲醇洗脱，收集洗脱液，每份1/2倍柱体积，通过TLC薄层色谱指导，展开剂为三氯甲烷甲醇甲酸=5 3 1，紫外波长为254nm和360nm，对洗脱液中含有相同成分的部分进行合并，得到化合物II粗品。经过低温析晶得到，化合物I为高熊果酚苷，101. 66mg，纯度为96%。化合物II为金 丝桃苷，87. 91mg，纯度为95%。
权利要求
1.从鹿蹄草中分离纯化高熊果酚苷和金丝桃苷的方法，具体包括如下步骤 (1)提取将鹿蹄草全株粉碎，按照每克原料加入70 90%乙醇10-20ml的比例进行热回流或者超声波辅助提取，提取液合并、浓缩至相对密度为I. 12-1. 20 ； (2)富集将上述浓缩提取液通过大孔吸附树脂柱，以不同浓度的乙醇水溶液梯度洗脱，收集富含目标物质的洗脱溶液，浓缩至干，得到目标物的富集产物； (3)分离纯化取上述富集产物依次经过SephadexLH-20型凝胶柱层析和ODS-C18反相中压硅胶柱层析分离纯化，得到纯度为82-87%的高熊果酚苷和金丝桃苷产品； (4)上述高熊果酚苷和金丝桃苷产品经过低温析晶和重结晶得到纯度大于95%的纯品O
2.按照权利要求I所述的从鹿蹄草中分离纯化高熊果酚苷和金丝桃苷的方法其特征在于步骤(I)所述的鹿蹄草全株来源于鹿蹄草、兴安鹿蹄草或红花鹿蹄草，主要是采用阴干的鹿蹄草全株，进行粉碎处理。
3.按照权利要求I所述的从鹿蹄草中分离纯化高熊果酚苷和金丝桃苷的方法其特征在于步骤(I)所述的热回流或者超声波辅助提取技术，提取所用的溶剂，每克鹿蹄草粉末加入10 20ml的70 90%乙醇，提取时间为40 50min，温度40 75°C，其中，超声波辅助提取功率为32 40KHz，每次过滤后将固体重复提取过程，此过程重复至少2次，合并提取液，减压浓缩至密度为I. 12-1. 20。
4.按照权利要求I所述的从鹿蹄草中分离纯化高熊果酚苷和金丝桃苷的方法其特征在于步骤(2)所述的利用大孔吸附树脂对目标产物的富集技术，所用树脂包括AB-8、NKA-9或DlOl型广谱性大孔吸附树脂，方法中大孔树脂吸附步骤采用湿法装柱，保留液面，将提取浓缩所得的固形物用水配制成料液浓度为10 30mg/ml的混悬药液，上样量O. 5 I. 5倍柱体积，先用2倍柱体积的水洗杂质，再依次用4 6倍柱体积，乙醇浓度分别为10%、30^^50%和70%的溶剂系统进行梯度洗脱解吸，洗脱流速为5 10ml/min，分别收集各梯度的洗脱液，合并乙醇浓度30 50%部位的洗脱液，将合并的洗脱液在不超过60°C条件下减压浓缩至无明显液体流出。
5.按照权利要求I所述的从鹿蹄草中分离纯化高熊果酚苷和金丝桃苷的方法其特征在于步骤(3)所述的凝胶Sephadex LH-20柱层析分离技术，将大孔吸附树脂富集浓缩的产物用15 20%甲醇溶解,配制成料液浓度为5 20mg/mL的样品液,经O. 45 μ m滤膜过滤后，按照100 150mg样品/ml凝胶,注入Sephadex LH-20凝胶柱,用水-甲醇体系梯度洗脱，先用20%甲醇2 5倍柱体积洗脱、然后用40%甲醇3 7倍柱体积洗杂质、最后用60%甲醇4 7倍柱体积洗脱，收集洗脱液,每份1/5 1/2倍柱体积通过TLC薄层硅胶色谱指导，展开剂为三氯甲烷甲醇甲酸=5 : 4 : I 5 : I : 1，紫外波长为254nm和360nm，对洗脱液中含有相同成分的部分进行合并，分别进行减压浓缩，20%部分得到化合物I粗品。
6.按照权利要求I所述的从鹿蹄草中分离纯化高熊果酚苷和金丝桃苷的方法其特征在于步骤(3)所述的ODS-C18反相中压硅胶柱层析分离技术，将凝胶Sephadex LH-20柱层析分离合并后得到60%部分用2 8%甲醇溶解，配制成料液浓度为5 10mg/mL，上样量O.I O. 5倍柱体积，O. 45 μ m滤膜过滤后注入柱体积为50 150ml的ODS-C18反相中压硅胶柱，用水-甲醇体系梯度洗脱，先用10%甲醇2 5倍柱体积洗杂质、然后用30%甲醇3 7倍柱体积洗脱，收集洗脱液，每份1/4 1/2倍柱体积，通过TLC薄层色谱指导，展开剂为三氯甲烷甲醇甲酸=5 : 4 : I 5 : I : 1，紫外波长为254nm和360nm，对洗脱液中含有相同成分的部分进行合并，得到化合物II粗品。
7.按照权利要求I所述的从鹿蹄草中分离纯化高熊果酚苷和金丝桃苷的方法其特征在于所述的低温析晶和重结晶技术，重结晶所用的溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷中的一种与甲醇、丙酮、乙腈或乙醇中的一种，以15 1-1 I的比例混合，低温析晶温度为-10°C 10°C。
全文摘要
本发明涉及从中草药中提取分离纯化活性成分的方法，具体涉及从鹿蹄草中提取、分离纯化活性成分高熊果酚苷和金丝桃苷的方法。目的是提供一种简便、安全、经济有效的从鹿蹄草中分离纯化高纯度高熊果酚苷和金丝桃苷的方法。本发明所采用的技术方案是将干燥的鹿蹄草全株粉碎，用乙醇提取，获得提取物。将提取物依次通过大孔吸附树脂、Sephadex LH-20凝胶及ODS-C18反相中压硅胶柱层析分离，结合低温析晶和重结晶技术得到精制的纯度达95％以上的高熊果酚苷和金丝桃苷。该方法的原料丰富易得，工艺简单易行，得率高，纯度高，操作安全、环保，适用于工业应用。
文档编号C07H17/07GK102731595SQ20111009157
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月13日 优先权日2011年4月13日
发明者付玉杰, 姚晓慧, 祖元刚 申请人:东北林业大学, 付玉杰