专利名称：一株高产l-乳酸的鼠李糖乳杆菌菌株及发酵木薯、甘蔗糖蜜产乳酸的方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，具体为利用微生物发酵生产L-乳酸领域，涉及到1株高产L-乳酸的鼠李糖乳杆菌菌株及利用该菌株发酵木薯淀粉和甘蔗糖蜜生产L-乳酸的工艺方法。
背景技术：
乳酸最早由瑞典化学家席勒(Scheele)在酸乳中发现，学名α -羟基丙酸，为世界上公认的三大有机酸之一，已成为一种重要的食品化工原料，目前已被广泛应用于食品、医药、饲料、农药、日用化工、皮革和纺织等行业。结构上，乳酸的分子含有一个不对称碳原子， 因此具有D-型和L-型两种构型。同时乳酸还具有旋光性，其中L-乳酸为右旋性，D-乳酸为左旋性，DL-乳酸为消旋性。由于人和许多哺乳动物只能代谢L-乳酸，摄入过量的D-乳酸会引起代谢紊乱甚至中毒，因此，L-乳酸被专门用于食品、医药、兽药和饲料工业，作为生产原料或产品添加剂，更引起人们的重视。近年来，随着环境的恶化及石油等化石资源的日益枯竭，国内外以L-乳酸为原料，开发可生物降解的新型环保材料聚乳酸(PLA)，对L-乳酸需求量急剧增长。可见，L-乳酸对工农业生产和人民生活均具有重要意义。至今，乳酸的工业生产主要有化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。化学合成法主要有乙醛氢氰酸法和丙酸法二种工艺，前者以乙醛和氢氰酸为原料，后者以丙酸为原料， 均存在工艺复杂，工艺条件较为剧烈，生产成本较高，产品残留有毒原料，只能得到外消旋的乳酸产品等不足，产品的利用受到了极大的限制，目前只有少数厂家使用。酶转化法目前主要有2-氯丙酸酶法和丙酮酸酶法，前者由日本发明，利用来自恶臭假单孢菌和假单孢菌的L-2-卤代酸脱卤酶和DL-2-卤代酸脱卤酶，作用底物DL-2-氯丙酸，合成L-乳酸或D-乳酸。后者由美国Hummel等人发明，利用D-乳酸脱氢酶作用无旋光性的丙酮酸底物，得到D-乳酸。酶转化法虽然可以获得光学纯的乳酸产品，但工艺比较复杂，对生产原料的要求较高，尚未能用于工业化生产，有待于进一步研究。微生物发酵法不仅可以获得光学纯的乳酸产品，而且原料来源广泛，产品中各种有害、有毒残留物较少，生产成本较低，工艺条件温和，是目前国内外乳酸工业生产的主要方法，也是L-乳酸产业今后发展的主要工艺。L-乳酸的发酵生产目前主要利用二大类微生物作为生产菌株，一是霉菌，主要是根霉(Rhizopus royzae)，另一为细菌。利用根霉发酵生产乳酸的优点主要是对原料处理的要求较低，可利用淀粉直接发酵，无需进行糖化等预处理，可以利用菌株的特性实现酸性发酵，利用低PH条件防止发酵过程的杂菌污染，免去对培养基的灭菌处理，降低发酵能耗和成本，发酵后对发酵液的分离净化也比较容易，而且可获得高光学纯度的L-乳酸产品。 不过，霉菌发酵生产L-乳酸也存在许多不足1、发酵副产物较多，产品转化率较低。霉菌的 L-乳酸发酵属异型发酵，在产出L-乳酸的同时伴有富马酸、琥珀酸、甘油和乙醇等大量副产物产生，导致发酵的产品转化率和产酸率均偏低，目前工业生产的转化率只有80 90%;2、发酵醪液的L-乳酸含量(即乳酸产率)较低。目前生产上利用霉菌发酵生产乳酸的产酸率通常只有10% (W/V)左右；3、后续的产品纯化工艺复杂，成本较高。由于发酵醪液的 L-乳酸含量较低，同时还含有各种有机酸副产物，导致产品的分离、纯化较为困难，难以获得高纯度的产品，而且成本较高。目前，工业生产的L-乳酸产品纯度通常只有96%，更高纯度的产品价格相当高。4、由于霉菌为丝状真菌，菌丝发达，在发酵过程中容易形成大体积菌丝团，一方面引起发酵过程的传质困难，导致造成产酸速率较低、生产不稳定，另一方面也使发酵完成后的物料输送容易出现管道堵塞等现象。针对利用霉菌发酵生产L-乳酸所存在的这些问题，近年来国内外开展了利用细菌发酵生产乳酸的研究。用于L-乳酸发酵生产的细菌主要有乳杆菌属(Lactobaci 1 Ius)、链球菌属 (Str印toccoccus)、芽胞杆菌属(Bacillus)以及最近报道的肠球菌属(Enterococcus)。与霉菌的乳酸发酵不同，细菌的乳酸发酵属于同型发酵，副产物较少，产品转化率较高。其中， 以乳杆菌属的鼠李糖乳杆菌(Lb. rhamnosus)发酵生产L-乳酸在转化率、产品光学纯度等方面更具有优势而受到重视。不过，利用该菌发酵生产L-乳酸的产酸率目前最高只有14% 左右，转化率只有90%，尚有提高的必要。原材料利用方面，至今L-乳酸的发酵生产主要以小麦和玉米为原料。木薯是热带、南亚热带地区重要的经济作物，具有种植面积广泛、易于生长、耐旱耐瘠、价格便宜、淀粉含量高等特点。广西是中国最大的木薯生产基地，原料丰富。甘蔗糖蜜是甘蔗制糖的副产物，形成量约为制糖用蔗重量的2. 3 4. 2 %，具有原料价格便宜，来源丰富等优势。以木薯淀粉和甘蔗糖蜜为原料发酵生产L-乳酸，不仅具有重要的工业意义， 而且符合国家利用非粮作物发展经济的政策。
发明内容
本发明针对目前L-乳酸发酵生产所存在的问题，提供一株高产L-乳酸的鼠李糖乳杆菌菌株及其发酵木薯淀粉、甘蔗糖蜜高产L-乳酸的特性及工艺方法。本发明所提供的菌株的命名为SCT-10-10-60，分类命名为鼠李糖乳杆菌(Lb. rhamnosus)，是发明人以鼠李糖乳杆菌JCM 1553菌株为原始菌株，采用紫外和Co6°照射联合诱变，选育得到的生长速率快、发酵周期短、产量高的L-乳酸生产菌株，已于2010年2月 1日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. :M2010039。1.菌株的诱变选育以日本微生物保藏中心(Japan Collection of Microorganizm)保藏号为JCM 1553的鼠李糖乳杆菌(LactcAacillus rhamnosus)菌株为出发菌株，进行诱变育种。首先， 将出发菌株接种MRS培养基(含蛋白胨，牛肉膏，0.5%酵母粉，2%葡萄糖，0. Tween 80，0. 26% K2HPO4 · 3H20，0. 5 % 乙酸钠，0. 2 % 柠檬酸氢二铵，0. 02% MgSO4 · 7H20, 0. 0056 % MnSO4 · IH2O,自然 pH，121 °C 20min 灭菌)，在 37°C，200rpm 下培养过夜活化二次，再将活化的菌体接种相同培养基，同条件培养8小时至对数期，菌数达2X 108/ml，取IOml菌液，12000rpmX5min离心，无菌蒸馏水洗涤2次，最后收集菌体悬浮在相同体积的无菌生理盐水中，用30WX30cm的紫外线对菌液进行不同时间的照射诱变。分别取0. Iml不同时间照射后的菌液，接种IOmlMRS培养基，暗培养2天，然后将菌液划线接种MRS平板培养基(液体 MRS培养基加2%琼脂糖)，37°C培养2 3天，挑单菌落接种MRS培养基同上活化后，接种乳酸耐受培养基(含20%乳酸钾，其余同MRS培养基)，于37°C下培养4天，期间每天检查菌体的生长情况，选择乳酸耐受能力最强的菌株，经同样条件活化后，按同样的方法制备菌体悬浮液，用不同剂量的Co6°进行诱变，再按同法筛选乳酸耐受最高的菌株，活化后接种乳酸发酵培养基(含20%的葡萄糖，10%的CaCO3, 3%的酵母粉，自然pH，121°C灭菌20min)， 进行乳酸发酵，期间每8小时抽样用L-乳酸分析仪检测发酵液的L-乳酸含量，挑选L-乳酸含量最高的发酵管划线接种MRS平板培养培养纯化3次，得到本发明所提供的鼠李糖乳杆菌L-乳酸高产菌株。用此方法，发明人对鼠李糖乳杆菌JCM 1553菌株进行紫外线和Co6° 联合诱变，从200多株的突变株中筛选得到1株L-乳酸高产菌株，命名为STC-10-10-60。2.菌株L-乳酸发酵的特性2.1菌株发酵葡萄糖产L-乳酸菌株接种MRS培养基同上培养过夜活化二次后，再接种MRS培养基，接种量1 %， 370C，200rpm培养8小时至对数期，菌数2 X 108/ml，接种葡萄糖发酵培养基(同上，含葡萄糖20 %，W/V)，接种量6 %，于37°C，200rpm条件下发酵，结果表明，菌数随发酵时间增长，发酵60小时发酵液的0D_达到了 26. 99 (稀释后测定)，发酵60小时的L-乳酸含量达到了 19. 57% (W/V)，发酵液的葡萄糖含量降低到1.08% (W/V)，乳酸转化率达到了 97. 85%。采用膜分离技术将乳酸纯化后，L-乳酸的光学纯达到了 98% (W/W)以上。2. 2菌株发酵木薯淀粉产L-乳酸将木薯干片用悬垂粉碎机粉碎至40目，加水调成31 %的浆液，按木薯粉的重量添加2ppm的液化酶(诺维信Liquozyme Supra α -淀粉酶)，95°C加热1小时，再按木薯粉的重量添加6ppm的糖化酶(诺维信Dextrozyme DX)，60°C保温48小时，得到木薯酶解糖液。以此糖液配制乳酸发酵培养基(含总糖25. 79 %，CaCO3IO %，酵母粉3 %，自然pH，121°C 灭菌20分钟)。将STC-10-10-60菌株同上活化和培养种子液，接种木薯发酵培养基进行 L-乳酸发酵，条件37°C或47°C，200rpm。结果37°C下发酵72小时的菌数达到了最高，为 33. 8X 108/ml，发酵 60 小时的 L-乳酸产量为 15. 77% (W/V)，72 小时为 19. 67% (ff/V),84 小时达到了最大，为22.73% (W/V)，残留葡萄糖发酵60小时为11. 37% (W/V)，72小时为 7. 14% (W/V)，84小时达到最低，为6. 55% (W/V)。发酵的乳酸转化率为88. 13%。47°CT 发酵72小时的乳酸产量达到了 13.8% (W/V)，残留还原糖含量降低到2. 523% (W/V)，乳酸转化率达到了 84. 1%。纯化后L-乳酸的光学纯度达到了 98% (W/W)以上。2. 3菌株发酵甘蔗糖蜜产L-乳酸将甘蔗制糖所产生的甘蔗糖蜜(丙蜜)加水稀释至36° Bx，按重量添加IOOppm 的聚丙烯酰胺絮凝剂使糖蜜絮凝，过滤，取清液，用盐酸(食用级)调PH至1.5，加热至微沸100分钟，使糖蜜的蔗糖转化为转化糖，加NaOH中和至pH6. 5，所得糖蜜水解糖液用于制备发酵培养基。将SCT-10菌株同上活化和培养种子液，接种糖蜜发酵培养基(含总糖 21.34%, CaCO3IO %，酵母粉3%，自然pH，121°C灭菌20分钟)进行L-乳酸发酵，条件 37°C，200rpm。结果发酵56小时的菌数达到了最高，为21. 04X 108/ml，发酵48小时的乳酸产量为14.0% (W/V)，56小时达到了最大，为19.60% (W/V)，残留葡萄糖发酵48小时为 0. 98% (W/V)，56小时达到最低，为0.95% (W/V)。乳酸转化率达到了 91. 85 %。纯化后 L-乳酸的光学纯度达到了 98% (W/W)以上。3.菌株利用木薯淀粉和甘蔗糖蜜发酵产L-乳酸的工艺方法
3.1原料处理木薯淀粉和甘蔗糖蜜用于L-乳酸发酵前需进行水解成糖液。其中，木薯淀粉用酶法进行糖化，甘蔗糖蜜用酸法糖化。处理步骤如下1)木薯淀粉酶解糖化可利用木薯粉(淀粉含量为68 70%，W/W)或精制的木薯粉(淀粉含量85%， W/W)进行。糖化时，先将木薯粉加水调成含粉量约四 30% (W/V，木薯粉)或20 22% (W/V，精制木薯淀粉)的浆液，按粉的重量添加2ppm的淀粉液化酶(所用酶为诺维信公司 Liquozyme Supra,酶活力为90KNU. g-1，每KNU是指在37°C，pH 5. 6条件下，每小时水解 5. 26克淀粉所需酶量)，95°C酶解1小时，待液温降低到60°C时，向浆液按粉重添加6ppm的淀粉糖化酶(诺维信公司Dextrozyme DX,酶活力为500AGU. πιΓ1。每AGU单位指在25°C、 PH 4. 3、反应30分钟条件下，每分钟水解1微克分子的麦芽糖所需酶量)，保持60°C温度48 小时，得木薯淀粉的酶解糖化液。木薯淀粉的酶解糖化也可利用其他液化酶和糖化酶，要求酶的性能与本专利所用酶相同，添加量按酶的活力进行调整。只要将木薯淀粉转化成葡萄糖，将不影响本专利技术的实施。2)甘蔗糖蜜水解转化甘蔗制糖所产生的丙蜜锤度约80° Bx，总糖含量约50%。使用时，将糖蜜用水稀释至36 40° Bx(具体按糖蜜的含糖量及发酵对糖含量的要求确定)，按稀释后糖蜜的重量添加IOOppm的聚丙烯酰胺，使糖蜜发生絮凝，用离心或过滤的方法将其中的絮凝物去除，取清液，用食用盐酸调PH至1. 5，然后将液体加热至100°C保温100分钟，冷却，用20% (W/V)的NaOH溶液中和至pH6. 5，得甘蔗糖蜜转化糖液。3. 2发酵培养基配制将上述所得的糖液调整为发酵所需的含糖量，按糖液的体积加入10%的CaCO3作为发酵过程的中和剂和3%的酵母粉作为发酵所需的氮源，加热至121°C灭菌20分钟，也可采用瞬时灭菌的方法，加热至140°C灭菌4秒钟，得到发酵培养基。3. 3菌株的活化SCT-10菌株用于L-乳酸发酵前需进行活化，以确保菌株具有稳定的发酵性能。活化按微生物的常规方法进行。将菌株接种MRS培养基(配方将前文)，37°C，200ppm培养过夜，在同样操作活化1次(共活化2次)，得到发酵性能稳定的菌株用于L-乳酸发酵。3. 4种子液培养将活化的菌株接种MRS培养基，接种量1 % (V/V)即可。用于接种的菌液菌数含量必须在2X108/ml以上，菌数不够需按比例增大接种量。接种量增大至10%对后续的L-乳酸发酵没有影响。接种后，将菌液同3. 3条件培养8小时，使菌数达到2X 108/ml，即得到发酵种子液。菌数达不到要求的菌数时要求适当延长培养时间。3. 5L-乳酸发酵将3. 4培养获得的种子液接种到3. 1或3. 2所制备的糖液中，根据生产需求在 37°C或47°C，200rpm条件下进行乳酸发酵，期间要求每8小时抽样检测发酵液的菌数、还原糖含量和L-乳酸含量，当乳酸含量达到最高时(一般发酵60小时左右，具体见实施实例) 终止发酵，将发酵液用于下游的乳酸分离纯化。发酵时间过长会导致乳酸含量变低。通过上述五步，将可有效实施本专利发明。
与现有技术相比，本发明具有的实质性特点和显著的进步1、显著提高L-乳酸发酵的产酸率目前，L-乳酸的生产以微生物发酵法为主，以米曲霉、根霉等霉菌和乳杆菌、链球菌、芽胞杆菌、肠球菌等细菌为生产菌株，以霉菌为生产菌株的发酵产酸率只有10%左右， 以细菌(主要为鼠李糖乳杆菌)为生产菌株的产酸率最高也只有14% (W/V)。本发明提供的鼠李糖乳杆菌STC-10-10-60菌株能利用木薯淀粉和甘蔗糖蜜为原料发酵生产L-乳酸， 产酸率达18%以上，最高达22%，较现在最高水平的产酸率(14% )提高28. 5%以上，显著提高L-乳酸发酵的产量。2、显著提高发酵温度发酵法生产L-乳酸原来以霉菌(米曲霉、根霉)为生产菌株，但存在产酸率较低、 副产物较多，转化率较低等问题。近年来转向用细菌(乳杆菌、链球菌、芽胞杆菌、肠球菌) 作为生产菌株，发酵温度一般为37°C。在此温度下，各种可能污染的杂菌均能很好生长，导致生产过程控制杂菌污染比较困难。本发明提供的鼠李糖乳杆菌STC-10-10-60菌株能够在47°C的温度下良好发酵高产L-乳酸，利用高温可有效抑制杂菌的生产，为生产控制提供了相当有利的条件，对生产具有重要的意义。3.显著提高发酵速度同上所述，目前L-乳酸的发酵生产主要以霉菌和细菌为生产菌株，霉菌的发酵时间相当长，一般为144小时(6天)，细菌的发酵时间也要72小时，而本发明提供鼠李糖乳杆菌STC-10-10-60发酵60小时就可产18% (W/V)以上的L-乳酸，显著降低发酵时间，这将有效提高生产效率，增加产量和降低生产劳动成本。4、扩大生产原料目前，L-乳酸的发酵生产主要以小麦、玉米等粮食为原料，存在与人类社会争粮、 争地等问题，大规模生产时原料来源将受到限制，而且成本较高。我国的广西、云南等拥有资源相当丰富的木薯和甘蔗糖蜜等资源，前者属非粮作物，后者为制糖工业的废弃物，利用这些资源发酵生产L-乳酸，不仅可变废为宝，显著降低生产成本，而且可避免与人类争粮、 争地的问题，符合国家的发展战略，具有相当重要的产业意义。
图1是鼠李糖乳杆菌STC-10-10-60菌株在20% (W/V)葡萄糖发酵培养基中的 L-乳酸发酵曲线。其中■_葡萄糖变化曲线；〇_菌数变化曲线，OD6tltl5A-L-乳酸变化曲线。图2是鼠李糖乳杆菌STC-10-10-60菌株在25% (W/V)葡萄糖发酵培养基中的 L-乳酸发酵曲线。其中■_葡萄糖变化曲线；〇_菌数变化曲线，OD6tltl5A-L-乳酸变化曲线。图3是鼠李糖乳杆菌STC-10-10-60菌株在30% (W/V)葡萄糖发酵培养基中的 L-乳酸发酵曲线。其中■_葡萄糖变化曲线；〇_菌数变化曲线，OD6tltl5A-L-乳酸变化曲线。图4是鼠李糖乳杆菌STC-10-10-60菌株利用木薯粉发酵产L-乳酸的发酵曲线。 其中■-葡萄糖变化曲线；〇_菌数变化曲线，OD600 ；▲ -L-乳酸变化曲线。木薯粉(40目)先调成31% (W/V)的浆液，用液化酶(诺维信Liquozyme Supra α-淀粉酶，按木薯粉重量添加2ppm)与95°C下液化1小时，再用糖化酶(诺维信Dextrozyme DX,按木薯粉重量添加6ppm)糖化48小时，所得木薯糖化液用于L-乳酸发酵。培养基含来自木薯的葡萄糖 25. 79% (W/V)，酵母粉 3% (W/V)，CaCO3IO% (W/V)，自然 pH，121°C灭菌 20 分钟。图5是鼠李糖乳杆菌STC-10-10-60菌株利用甘蔗糖蜜发酵产L-乳酸的发酵曲线。其中■-葡萄糖变化曲线；O-菌数变化曲线，0D_ ；-L-乳酸变化曲线。甘蔗糖蜜用水稀释至40° Bx，加IOOppm(W/W)的聚丙烯酰胺沉淀，过滤，取滤液，用食用盐酸调pH至 1. 5，煮沸100分钟水解成转化糖液，冷却，用于配制发酵培养基。培养基含总糖21. 34% (W/ V)，酵母粉 3% (W/V)，CaCO3IO% (W/V)，自然 pH，121°C灭菌 20 分钟。图6是鼠李糖乳杆菌STC-10-10-60菌株利用木薯粉在47°C下发酵产L-乳酸的发酵曲线。其中■-葡萄糖变化曲线；O-菌数变化曲线，0D_ ；A-L-乳酸变化曲线。木薯淀粉的酶解糖化同图4。发酵条件47°C，200rpm。图7是鼠李糖乳杆菌STC-10-10-60菌株发酵所产乳酸的其它有机酸含量分析，表明发酵产物中不含有其它有机酸，乳酸的纯度达到99.6%。分析方法为高效液相(HPLC)， 仪器美国戴安(Dionex)U3000HPLC分析仪，色谱柱菲罗门(Phenomenex)公司有机酸分析(Organic Acid)柱，流动相5mmol/L硫酸，流速0. 6ml/min,检测器戴安U3000紫外 (Variablewavelenth UV-Vis)检测器，检测波长210nm。图8是鼠李糖乳杆菌STC-10-10-60菌株发酵所产乳酸的光学纯度分析，表明菌株发酵所产L-乳酸的光学纯度达到98. 02%。分析方法为高效液相(HPLC)。仪器Waters 600高效液相色谱仪，色谱柱菲罗门(Phenomenex) Chirex-3U6手性柱，流动相2mmol/L 硫酸铜-5% (V/V)异丙醇溶液，流速1. Oml/min，检测器:waters 2487紫外(UV-VIS)检测器，检测波长2Mnm。保藏信息说明一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) SCT-10-10-60，真空冷冻干燥保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址为武汉市武汉大学，保藏号为 CCTCC NO :M2010039，保藏日期为2010 年 2 月 1 日。
具体实施例方式实施例1 利用木薯粉发酵高产L-乳酸先将木薯干片(淀粉含量68-70%，W/W)用悬垂粉碎机粉碎至40目，用水调成的浆液，按木薯粉的重量加入2ppm的淀粉液化酶(诺维信公司Liquozyme Supra,酶
活力为90KNU. g—1，每KNU是指在37 °C，pH 5. 6条件下，每小时水解5. 26克淀粉所需酶量)， 95°C下水解液化1小时，再向液化的淀粉液木薯粉的重量加入5ppm的淀粉糖化酶(诺维信公司Dextrozyme DX，酶活力为500AGU. πιΓ1。每AGU单位指在25°C、pH 4. 3、反应30分钟条件下，每分钟水解1微克分子的麦芽糖所需酶量)，于60°C下糖化48小时，得木薯酶解糖化液。取糖化液200ml，加入10% (W/V)的CaCO3, 3% (W/V)的酵母粉，121°C灭菌20分钟， 得发酵培养基备用。将STC-10-10-60菌株按前文接种MRS培养基培养过夜活化二次，再接种MRS培养基培养种子液，菌数达2 X 108/ml以上。将种子液接种木薯发酵培养基，接种量 6% (V/V)，于37°C，200rpm下发酵84小时，L-乳酸产率达到了 22. 3% (W/V)，还原糖含量降低到6. 55% (W/V)，乳酸转化率88. 13%。
实施例2 利用木薯淀粉发酵高产L-乳酸将市售的木薯淀粉(淀粉含量85%，W/W)用水调成21%的浆液，同上添加淀粉液化酶和淀粉糖化酶酶解糖化的淀粉酶解糖液。取200ml淀粉糖液，添加10% (W/V)的 CaCO3和3% (W/V)的酵母粉，灭菌，得发酵培养基。将STC-10-10-60菌株同上活化后培养种子液。将种子液接种发酵培养基，接种量10%，37°C，200rpm下发酵72小时，L-乳酸产率为16.6%,乳酸转化率94. 1% ο实施例3 发酵甘蔗糖蜜高产L-乳酸来自甘蔗糖厂的甘蔗糖蜜(83.5° Bx，总糖含量49.5% )用水稀释至36° Bx，按糖蜜重量加IOOppm的聚丙烯酰胺絮凝，过滤，清液用食用盐酸调pH至1. 5，加热至100°C7K 解100分钟，冷却，用20% (W/V)的NaOH溶液中和至pH6. 5，得糖蜜水解糖液，含糖量21 % (W/V)，水解率98%。取糖蜜水解糖液，加10% (W/V)的CaCO3, 3% (W/V)的酵母粉，121°C 灭菌20分钟，得发酵培养基。将STC-10-10-60菌株同上活化后培养种子液。将种子液接种发酵培养基，接种量10% (V/V)，37°C，200rpm下发酵56小时，L-乳酸产率为19.6% (W/ V)，乳酸转化率92. 1%0实施例4 :47°C下发酵木薯粉高产L-乳酸木薯干片用悬垂式粉碎机粉碎至40目，加水调成含木薯粉20% (W/V)的浆液， 同上实施例1用淀粉液化酶和糖化酶将木薯粉水解成糖液(混浊浆状)，加10% (W/V)的 0^03和3% (W/V)的酵母粉，121°C灭菌20分钟，得发酵培养基。将菌株同上实施例一活化、培养得种子液。将种子液接种发酵培养基，于47°C，200rpm下发酵64小时，L-乳酸产量达到了 13.8% (W/V)，乳酸转化率为93.4%。
权利要求
1.一株高产L-乳酸的鼠李糖乳杆菌菌株，分类命名为鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillusrhamnosus)，菌株号为SCT-10-10_60，是将鼠李糖乳杆菌 JCM 1553 (Lactobacillusrhamnosus, JCM 1553)进行紫外线和Co6ci联合诱变，从突变体中筛选获得。真空冷冻干燥保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :M2010039，保藏日期为2010年2月1日。
2.如权利要求1所述的生产菌，其特征在于所述菌株为L-乳酸高产菌，能够发酵葡萄糖、木薯粉、木薯淀粉和甘蔗糖蜜(丙蜜)高产L-乳酸，产率(发酵液的L-乳酸含量) 达到18%以上，发酵效率达到理论值的91%以上，最高达98%，发酵的乳酸产品的光学纯度达到98%以上。
3.如权利要求1所述的菌株，其特征在于能耐受高温，其温度耐受度为47°C。在该温度下利用木薯为原料发酵的L-乳酸产率仍达到13%。
4.利用权利要求1所述的生产菌发酵木薯、甘蔗糖蜜生产L-乳酸的方法，其特征在于生产过程如下将菌株按微生物发酵常规液体种子培养方法，即以MRS培养基， 即葡萄糖20g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/l、Tween 801ml/L、 K2HPO4 · 3Η202· 621g/L、乙酸钠 5g/L、柠檬酸氢二铵 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、MnSO4 · H2O 0. 056g/L，pH6. 5，进行培养，先在30°C，200rpm下培养过夜活化2次，再接种同样的培养基培养种子液，当每毫升培养液含鼠李糖乳杆菌数达到IO8个以上时，按1 10%的接种量转接到发酵培养基。培养基用木薯粉、木薯淀粉或甘蔗糖蜜水解糖化液配制，添加10% (W/V) 的CaCO3和2% (W/V)的酵母粉。在37°C，200rpm下发酵60 72小时，期间定时抽样检查发酵液的L-乳酸含量，当L-乳酸含量达到最高时表示发酵完成，终止发酵。
全文摘要
本发明公开了一种高产L-乳酸的鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株(SCT-10-10-60)，该菌株在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)的保藏号为CCTCC NO.M2010039，以及采用该菌株发酵木薯粉、木薯淀粉和甘蔗糖蜜高产L-乳酸的工艺方法。该菌株具有高温发酵、高产L-乳酸的特性。将木薯粉(或木薯淀粉)或将甘蔗糖蜜为原料，添加10％(W/V)的CaCO3和3％(W/V)的酵母粉，在接种量5～10％(V/V)，37℃下发酵64～72小时的L-乳酸产酸率达到18％(W/V)以上，发酵效率达到91％以上，最高达98％。47℃下发酵64小时的L-乳酸产量可达到13％(W/V)以上，乳酸转化率90％以上。发酵所产L-乳酸的光学纯度可达98％以上。本发明技术可显著提高目前L-乳酸发酵生产产量、发酵效率和产品的光学纯度，具有很强的实用价值和工业价值。
文档编号C12R1/225GK102304480SQ20111003904
公开日2012年1月4日 申请日期2011年2月16日 优先权日2011年2月16日
发明者唐检秀, 孙菲菲, 孙靓, 陈东, 黄日波, 黄艳燕 申请人:广西科学院