一种益生菌产品中活性鼠李糖乳杆菌快速分离与计数方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种能够特异性识别鼠李糖乳杆菌表面蛋 白的抗体以及益生菌产品中活性鼠李糖乳杆菌快速分离和计数方法。
【背景技术】
[0002] 益生菌（probiotics)是指通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活 性微生物制剂，具有改善肠道菌群结构，抑制病原菌，生成营养物质，提高机体免疫力，消除 致癌因子，降低胆固醇和血压，改善乳糖消化性等功能。益生菌产品种类繁多，包括含益生 菌的酸牛奶、酸乳酪、乳酸菌饮料、酸豆奶及含多种益生菌的口服液、片剂、胶囊、粉末剂等， 但由于市场不健全以及发酵乳生产厂家设备条件和技术水平千差万别，益生菌产品质量参 差不齐，许多产品仍然存在着质量问题，如活菌数不达标，产品种属标签与产品中实际的菌 种不符等。
[0003] 鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)是目前公认的益生性乳杆菌，具有保 持肠道微生态平衡，抑制有害细菌生长，消除过敏等生理功能。传统发酵食品和益生菌制 剂是补充益生菌良好的来源和载体。随着益生菌的深入研宄，从传统发酵食品中分离鼠李 糖乳杆菌用以研制新型益生菌制品已成为功能食品科研开发的热点，另一方面准确测定产 品中鼠李糖乳杆菌及其活菌数量是评估益生菌制剂质量与功效的主要依据。但目前在复杂 菌群体系中定量检测和鉴定鼠李糖乳杆菌的有效活菌数仍缺乏科学、合理、快速的方法。传 统方法易受培养条件、菌种特性等因素影响，并且检测效率有限，而现有的选择性培养基技 术需要添加选择性抑制因子，灵敏度不高，基于PCR技术的分子学方法虽然具有较高的灵 敏度，但是不能区分样品中的活菌和死菌。因此迫切需要建立适合复杂体系中鼠李糖乳杆 菌优良菌株分离筛选以及活菌计数的新方法。免疫分析法快速、特异、并且操作简单，为评 价益生菌产品、筛选理想菌株、跟踪复杂生态系统中的益生菌提供了高效、廉价的工具。但 由于鼠李糖乳杆菌特异性靶抗原研宄不多，目前尚没有鼠李糖乳杆菌特异性抗体及相关免 疫检测法，应用菌落免疫印迹快速鉴定和计数活性鼠李糖乳杆菌的方法国内外未见相关报 道。
【发明内容】
[0004] 本
【发明内容】
主要包括干酪乳杆菌群表面蛋白FimI抗体的制备和活性鼠李糖乳杆 菌的快速鉴定和计数方法。干酪乳杆菌群（Lactobacillus casei group)乳酸杆菌包括高 度相似的三个种：干酪乳杆菌；副干酪乳杆菌；鼠李糖乳杆菌。菌毛亚基FimI是三种菌共 有，但是只有鼠李糖乳杆菌的FimI是在细胞壁上，可以用FimI抗体建立方法来快速分离与 鉴定鼠李糖乳杆菌，并且与其它两种乳杆菌区分开来。
[0005] 本发明公开了干酪乳杆菌群菌毛亚基FimI在活性鼠李糖乳杆菌快速分离与计数 中的应用。
[0006] 本发明通过大肠杆菌表达系统获得干酪乳杆菌群的菌毛亚基FimI，重组FimI用 镍柱纯化后免疫小鼠获得多克隆抗体；将含有鼠李糖乳杆菌样品按常规处理后进行MRS平 板涂布，37°C厌氧培养36h;以硝化纤维膜为固相载体进行菌落转印，转印膜通过干燥固 定、脱脂乳封闭、洗涤、加抗体孵育后用DAB显色；根据膜上出现明显斑点对样品中的活性 鼠李糖乳杆菌进行计数，同时通过斑点位置实现鼠李糖乳杆菌快速分离。该方法还能够快 速区分鼠李糖乳杆菌与遗传生理生化特征极为相近的干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌。本发明 方法操作简便有效，便于推广使用，适合于含有鼠李糖乳杆菌的益生菌产品的质量和功能 评价使用，具有极好的应用前景。
[0007] 本发明提供一种益生菌产品中活性鼠李糖乳杆菌快速分离与计数方法，其步骤包 括：1)干酪乳杆菌群特异性菌毛亚基FimI为靶抗原制备多克隆抗体；作为鼠李糖乳杆菌检 测抗体；
[0008] 2)利用检测抗体采用菌落免疫印迹法检测和定量样品中中的鼠李糖乳杆菌； [0009] 3)菌落免疫印迹结合MRS平板计数对样品中鼠李糖乳杆菌进行定量检测。
[0010] 具体包括以下步骤：
[0011] (I)FimI目的基因扩增：根据干酪乳杆菌菌毛蛋白亚基FimI核苷酸序列设计一 对特异性引物，上游引物 16F1 序列：5' -cccaagcttgatgaaaaagacaattgccaag-3'（SEQ ID NO. 1)，下游引物 16R1 序列：5' -aagctcgagttagaaaccattgcggcgc-3'（SEQ ID NO. 2)，并在 上下游引物引入Hind III和Xho I限制性内切酶酶切位点。用已知的改良CTAB法提取乳 酸菌基因组DNA，以基因组DNA为模板PCR扩增目的基因，PCR扩增程序：94°C预变性5min ; 94°C变性50s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，35次循环；72°C延伸lOmin。反应结束后，取 10 μ L产物在1. 5%的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后在凝胶系统上观察结果。
[0012] (2)重组表达载体的构建：PCR扩增产物纯化回收后与PGEM i_-T Easy载体连接构 建pGEMT-fiml，转化E. coli DH5 α，氨苄青霉素抗性平板筛选阳性克隆，并进行酶切和测 序鉴定。用Hindlll+Xhol分别双酶切pGEMT-fiml质粒和pET28a-SUM0载体质粒，试剂盒 回收目的片段，将载体和目的基因 FimI用T4DNA连接酶连接，16°C连接过夜，产物转化至 E. coli DH5a，卡那霉素抗性筛选阳性转化子，并进行PCR和酶切鉴定。将构建的重组质粒 pET28a-SUM0-fimI转化E. coli BL21 (DE3)感受态细胞，卡那霉素 LB平板筛选阳性克隆并 进行PCR和酶切鉴定，获得的阳性克隆命名为E. coli BL21-fimI。
[0013] (3)FimI蛋白的表达与鉴定：将Ε· coli BL21-fimI接种于IOmL含卡那霉素（含 100 μ g/mL卡那霉素）的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜；按照2 %的接种量接入50mL TB培养液（含100 μ g/mL Kana)中，37°C，200rpm培养至0D600值达到0· 6~0· 8,加入终 浓度分别为〇. IOmmoVL的IPTG诱导培养5h，离心收集菌体加入等体积PBS重悬，超声破 碎细菌，收集包涵体应用Ni-NTA层析柱对重组蛋白进行分离纯化。将溶解的包涵体加到 Ni-NTA层析柱，流速控制在0. 5mL/min。用10~20倍NTA体积平衡缓冲液洗（直至无蛋 白流出），流速控制在lmL/min左右。分别用10倍NTA体积洗脱缓冲液梯度洗脱，收集穿透 液，SDS-PAGE分析重组蛋白，割取SDS-PAGE凝胶上的目的条带，送至生物公司进行质谱鉴 定。
[0014] (4)重组FimI蛋白多克隆抗体的制备：将健康BALB/c小鼠在新环境下预养一周 后进行眼眶采血，分离血清作为抗血清效价检测时的阴性对照。以浓度为0. lmg/mL的重组 蛋白作为抗原，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，初次免疫剂量为〇. 〇5mg/只，对实验小 鼠进行腹部皮下多点注射；2周后进行第1次加强免疫（抗原量为初次免疫的1/2)，此后每 隔1周加强免疫1次，共3次；最后一次加强免疫完成5d后，对实验小鼠进行眼球取血。将 收集的血液于4°C放置2h，以3000rpm的转速离心10min，收集抗血清，-20°C保存。
[0015] (5)斑点免疫印迹方法的建立不同乳酸菌接种至MRS培养基，37°C厌氧培养36h， 4000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，PBS重悬菌体，调整菌体浓度为 OD_= 1. 0。剪取适当大小的硝酸纤维素膜，于去离子水中浸泡10min，37°C干燥IOmin ;分 别将10 μ L菌悬液点于膜上，37°C干燥15min ;加入5 %的脱脂乳，室温封闭Ih ;取出后用 PBST洗涤3次，加入适当稀释度的FimI抗血清（1:1000)，室温孵育Ih ;洗涤3次，加入HRP 标记的羊抗鼠 IgG(l: 1000稀释），孵育Ih ;洗涤3次，将膜浸入新配制的DAB显色液中，避 光反应lOmin，膜上出现明显斑点后，用去离子水漂洗2次终止反应，将膜置于干净滤纸上 自然干燥。
[0016] (6)菌落斑点免疫印迹法快速定量检测样品中的鼠李糖乳杆菌：将鼠李糖乳杆菌 和其他菌种等比例混合，用生理盐水梯度稀释，涂布MRS平板，37°C厌氧培养36h。剪取与 培养皿内径大小相同的硝酸纤维素膜，于去离子中浸泡l〇min，37°C干燥lOmin，将干燥后 的硝酸纤维素膜放置于培养基表面，使膜与培养基表面菌落充分接触，静置5min后将膜揭 下，37°C干燥30min，膜的封闭、一抗反应、二抗反应及显色程序同斑点免疫印迹法。根据转 印膜上的斑点数计算鼠李糖乳杆菌数，并根据斑点位置挑取克隆进一步确证。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)是目前公认的益生性乳杆菌，但是益 生菌产品种类繁多，包括含益生菌的酸牛奶、酸乳酪、乳酸菌饮料、酸豆奶及含多种益生菌 的口服液、片剂、胶囊、粉末剂等，但由于食品市场的不健全，生产厂家设备条件和技术水平 千差万别，质量参差不齐，许多产品仍然存在着一些质量问题，如活菌数不达标以及种属标 识不符等。本发明通过大肠杆菌重组表达抗原和小鼠免疫获得了鼠李糖乳杆菌表面蛋白 FimI的特异性抗体，应用该抗体免疫印迹方法结合常规MRS平板计数方法建立了菌落免疫 印迹技术，该技术能够应用于复杂微生态体系中鼠李糖乳杆菌的快速精确的计数与分离。
[0019] 干酪乳杆菌群的种属包括遗传和生理生化特征极为相近的干酪乳杆菌、副干酪乳 杆菌以及鼠李糖乳杆菌，用常规的鉴定方法费时耗力，而且准确度有限。本发明还能够快速 精确的区分鼠李糖乳杆菌与干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌，可应用与优良益生菌菌种的筛选 和鉴定。
【附图说明】
[0020] 图1 :应用FimI抗体建立斑点免疫印迹法对鼠李糖乳杆菌鉴定。
[0021] 图2 :应用FimI抗体建立菌落免疫印迹法对菌种混合体系中的鼠李糖乳