专利名称：一种鼠李糖乳杆菌Pr2肽及其编码基因、分离方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫医学领域，具体地，本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌Pr2肽及其 编码基因、分离方法和应用。
背景技术：
调节性T细胞(Tregs)在调控T细胞反应中起重要作用。Tregs能够在胸腺内外 产生。这种细胞表达转录因子Foxp3、 CD4、 CD25，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因 子受体和细胞毒性T淋巴细胞抗原-4。有活性的Tregs的抑制功能至少部分依赖于它 们表达的TGF-P、 IL-IO、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4或FasL。这些分子能够通过 诱导凋亡的途径使靶细胞死亡。在遗传性过敏症中，认为过敏原特异性Tregs功能的 失常与过敏原特异性Th2反应和过敏性炎症相关。大量研究报道也显示Tregs在防止 自身免疫性疾病和调节机体过激的免疫反应方面发挥重要作用。然而，诱导Tregs 产生的机制，特别是胸腺外抗原特异性Tregs细胞的产生机制仍未明了。
已经有报道尝试了一些用于产生治疗目的Tregs的方法在高浓度的IL-2培养
条件下扩增胸腺来源的Tregs被认为是一种简便易行的方法，然而，这种细胞增殖能
力差的特性限制了这种方法的运用；雷怕霉素一种抗生素，用于增殖天然的Tregs， 然而其结果还存在争议。
DCs在抗原呈递、初始T细胞活化和Thl或Th2细胞分化中具有关键作用，从 而在启动抗原特异性免疫反应或耐受[11]中起重要作用。最近研究进展显示共培养 初始T细胞和耐受性DCs能够显著增加Tregs的增殖，这项研究有望提供一个产生 Tregs的方法。然而，耐受性DCs的产生机制和它怎样确切的诱导Tregs产生机制仍 未被阐明， 一些生长因子包括IL-IO、转化生长因子p(TGF-(3)、粒细胞克隆刺激因 子、血管活性肠肽被认为起重要作用[14]。这些研究不仅显示在实验条件下产生和应 用耐受性或调节性DCs,可作为一种新的免疫抑制性治疗策略应用于免疫调控，而 且，还显示DCs在胸腺外抗原特异性Tregs发生发展中起重要作用。
肠道共生微生物菌群通过调节新陈代谢、局部和整体的免疫功能、防止病原微 生物繁殖，从而给机体带来明显益处。大量研究资料也表明肠道微生物菌群改变与 一些免疫和炎症反应相关，包括炎症性肠病(IBD)、过敏性疾病、关节炎。这些研究表明除了它们的己知功能外，肠道微生物还具有重要的免疫调节功能。基于以上研究结果， 一些共生的益生菌株如乳酸菌、双歧杆菌已经在临床和实验条件下用于抑制免疫功能紊乱性疾病。研究显示益生菌治疗作用要求用活的细菌有机体，这意味着起治疗作用的微生物分子只能由活的益生菌株产生。不幸的是，尽管在这方面已取得一些进展，但益生菌中起免疫调节作用成分的性质仍未了解，对益生菌免疫抑制作用的细胞和分子机制了解甚少。
发明内容
因此，本发明的发明人鉴定了一种鼠李糖乳杆菌培养上清液来源的肽-Pr2，能够使骨髓来源的DCs转化为免疫耐受表型，并使之产生IL-IO。这种Pr2刺激产生的003具有在体外诱导胸腺外抗原特异性？(^ 3+ Tregs产生的能力。此外，我们还证明了这种Tregs或纯化的Pr2能够在体内抑制肠道抗原特异性过敏反应。本发明的目的之一是提供一种鼠李糖乳杆菌Pr2肽。本发明的再一 目的是提供编码上述鼠李糖乳杆菌Pr2肽的基因。本发明的再一 目的是提供一种分离上述鼠李糖乳杆菌Pr2肽的方法。本发明的再一目的是提供上述鼠李糖乳杆菌Pr2肽在制备用于治疗免疫功能紊乱性疾病的药物中应用。
根据本发明的鼠李糖乳杆菌Pr2肽，其具有如SEQNo.l所示的氨基酸序列。SEQ No.l:
60
ENEAFA 66
本发明还提供了编码上述鼠李糖乳杆菌Pr2肽的基因。该基因可以具有如SEQ
No.2所示的核苷酸序列。SEQ No.2:
gcgatttttccgtggctggtggtggatggccagggcagccgcctgccgagcgcgaacgtgatgaacctgctgaccaccattcagatgctgtatgtggaacgctttccgcgcgaagtgggcgcggtgaccgattatgatgtg幼atatgaaatgtttggcgcgaaaattcgcggcaccaaagaaaacgaagcgtttgcg
本发明还提供了分离上述鼠李糖乳杆菌Pr2肽的方法，包括以下步骤
1) 鼠李糖乳杆菌aacto6ac/〃^i to w2omy)在MLR肉汤培养基中37°C培养24h，洗涤后，细胞进一步在MLR9中培养96h;
2) 离心去除细胞，疏水作用色谱法纯化上清液中蛋白，经旋转蒸发后，阳离子交换色谱法收集蛋白；
3) 收集的蛋白部分经SepPakC18反相柱脱盐后，经高压液相色谱法纯化；以及
4)收集有功能的部分。
本发明还提供了上述鼠李糖乳杆菌Pr2肽在制备用于治疗免疫功能紊乱性疾病的药物中应用。
本发明证实一种纯化的鼠李糖乳杆菌Pr2肽具有增加抗原特异性Tregs产生的能力。当再次暴露于特异性抗原时，产生的Tregs被激活并释放出功能性分子IL-lO、TGF-P和Fasl。通过过继转移抗原特异性Tregs和直接给予致敏小鼠Pr2和特异性抗原一样，都能够有效抑制机体内抗原特异性的Th2反应和超敏反应。
Tregs最初被认为在胸腺内产生，但越来越多的证据显示，在外周T细胞中也可诱导出Tregs。这一发现给Tregs的研究带来了新的希望，因为Tregs在克服免疫功能紊乱性疾病中具有治疗潜能。然而，要得到大量用于治疗目的的Tregs还存在障碍。本发明结果显示一种纯化的鼠李糖乳杆菌Pr2肽具有提高外周初始CD4+T细胞表达Foxp3，并产生Tregs的能力。在这一发现和以往的研究中，Tregs能够从初始CD4+T细胞产生的研究结果相一致。因为本发明己经分析了 Pr2的氨基酸序列，这就意味着不仅可以从培养上清液中纯化Pr2，也可以根据其氨基酸序列人工合成Pr2，因此，本发明提供了一条应用Tregs治疗免疫功能紊乱性疾病的新方法。
从外周T细胞中产生Tregs的机制还未被完全阐明。有报道称不同的分子参与了Tregs的产生，如IL-IO、 TGF- e 、雷怕霉素等[22，23]。本发明也揭示Pr2刺激后的DCs能够增加IL-10的表达，与这些DCs共培养时能够使初始的CD4+CD25T细胞转化成Foxp3+T细胞。而且这种转化能够被抗IL-10受体抗体预处理后而被阻止。本发明证实IL-10在经Pr2刺激产生Tregs过程中起重要作用，IL-10是该过程中的调控因子。尽管也有研究显示可能TGF-P也是Tregs产生中的重要因子，但我们并未检测到经Pr2刺激后的BMDCs中TGF- 0的增加，事实表明TGF- 0在Pr2诱导的Tregs转化中不起作用。
Stat3是IL-10表达的所需的转录因子。本发明也检测到了 Stat3在经Pr2刺激的BMDCs中的表达。尽管Stat3表达水平没有变化，但磷酸Stat3在给予Pr2后显著增加，而且经RNA干扰使Stat3基因沉默能够阻止Pr2诱导后的BMDCs中IL-10的表达，并消除对随后的Tregs的诱导作用。这一事实表明Stat3在Pr2刺激的BMDCs表达IL-IO中是一个独立因素。Fo邓3表达作为Tregs产生的指标，本发明观察了 Pr2刺激后的BMDCs使初始CD4+CD25T细胞转化为Foxp3+T细胞，但共培养的第一周期中只有20%的细胞发生转化，延长培养时间并不能提高Foxp3+T细胞的比率。微生物产物具有通过加强Fas/FasL途径使DCs细胞死亡的能力[24]，本发明也发现在与CD4+CD25T细胞共培养后Fas在BMDCs中表达增加。这一发现显示DCs细胞凋亡可能会削弱初始CD4+CD25T细胞向Tregs的转化，加入新的DCs后能够加强向Tregs的转化。确实在随后的实验中也证实了我们的推测，Foxp3+T细胞呈共培养周期数依赖性方式增加，因而多重的与Pr2刺激后的DCs共培养周期是体外产生Tregs所必需的。
本发明另一个新的发现是同时暴露于Pr2和特异性抗原能够进一步提高T细胞中Foxp3的表达。其机制可能是暴露于抗原OVA能增加BMDCs中T细胞受体诱导的共刺激受体配体(ICOSL)的表达，与抗诱导的共刺激受体(ICOS)抗体预处理后可阻止这种效应的发生。因活化的ICOS能增强效应性T细胞反应[25]，本发明中的这一发现表明ICOS/ICOSL间的相互作用能够上调Tregs的产生。
有报道称灌胃方式给予OVA能有效增加Peyer's斑中Tregs的数量，因此本发明试图从体外分离的免疫细胞中得到Tregs.，然而单独暴露于抗原OVA时并不能提高Tregs的产生，而同时暴露于OVA和Pr2时则能够增加Tregs的产生。值得注意的是产生的Tregs是抗原特异性的。作为对OVA抗原刺激的反应，OVA-iTregs可释放IL-IO、 TGF-e和FasL，而单独用Pr2刺激时则无明显变化。本发明显示抗原特异性的Tregs能够经暴露于特异性抗原而被激活。这种活化能够通过凋亡途径诱导抗原特异性效应性T细胞死亡。因抗原特异性效应性T细胞也能够同时被激活，抗原特异性Tregs来源的IL-10、TGF- P和FasL在Tregs活化后诱导的T细胞死亡中起关键作用。
Tregs在抑制过激的免疫反应中起重要作用，所以本发明旨在通过产生抗原特异性Tregs来抑制过激的Th2反应和过敏性疾病。体内外的实验结果表明过继转移给致敏后小鼠抗原特异性Tregs和给予Pr2/OVA —样对过敏性疾病都具有治疗作用，因为经上述处理后肠道内的Th2反应和超敏反应能够明显减轻或消除。
总之，鼠李糖乳杆菌来源的肽Pr2具有体外刺激产生Tregs的能力。同时暴露于Pr2和抗原能够产生抗原特异性Tregs，这种抗原特异性Tregs能够在再次暴露于特异性抗原时被激活。激活后的抗原特异性Tregs释放功能性分子IL-10、TGF-P和FasL。过继转移抗原特异性Tregs或给予致敏小鼠Pr2和特异性抗原能够明显抑制机体中抗原特异性Th2反应和过敏反应，从而这种方法在治疗过敏性疾病中具有潜在的应用价值。
图1表示Pr2增加BMDCs中IL-10的表达，A, BMDCs中IL-10 mRNA的表达；B，培养液中IL-10水平；C， BMDCs中IL-10和TGF-卩蛋白表达量；D， Pr2的氨基酸序列；E，为BMDCs对Pr2剂量反应研究中，IL-10 mRNA的表达；F，为BMDCs对Pr2剂量反应研究中，IL-10蛋白的表达；QBMDCs经Pr2刺激后，IL-10表达的
时间过程。
图2表示Pr2增加BMDCs中IL-10的表达，BMDCs经Pr2刺激后，提取总蛋白质，分别用抗Stat3和抗phosphorStat3抗体进行免疫印迹检测，A， Stat3免疫印迹；B， phosphor Stat3免疫印迹；C，乙酰基组蛋白H3印迹；D， IL-10启动子激活的PCR结果，*，p<0.01， si:表示经Stat3RNA干扰后在暴露于Pr2; E-J,流式细胞仪检测CDlle+细胞中IL-10的表达。
图3表示Pr2刺激BMDC使初始CD4+T细胞转化为Treg细胞A，表示Foxp3mRNA表达量，*表示？<0.05，与"0"组比较，B，表示Foxp3蛋白质表达量，I带表示Pr2冲击的BMDC共培养，II带表示先与抗IL-10受体抗体处理，在与Pr2冲击的BMDC共培养，m为e-actin， C-H,不同周期数时，Foxp3+T细胞量。
图4表示再次暴露于OVA时，OVA特异性Treg细胞表达高水平IL-IO,TGF- B和FasL， A，表示IL-10水平，B，表示FasL水平，C，表示IL-IO,TGF- B和FasL mRNA表达，D，表示IL-IO，TGF- B和FasL蛋白质表达，E，表示TGF- B和FasL在OVA-iTreg细胞表面的表达。
图5表示产生的Treg能够表达CCR9 A表示CCR9蛋白质表达，B表示固有层内CFSE阳性细胞，C表示对照组。
图6表示鼠李糖乳杆菌上清液来源的肽Pr2抑制肠道内OVA特异性过敏反应
A， OVA特异性IgE水平，B，血清中IL-4和IFN^水平，C，分离的肠道CD4+T细
胞经OVA刺激后与^H]胸苷结合水平，D，肥大细胞脱颗粒计数，*，p<0.05， naive:
未处理小鼠，OVA1:只给以OVA小鼠组，OVA2，给以OVA+明矶组，OVA3，给
以OVA+明砜后再给以Pr2+OVA。
图7 Pr2/OVA对肠道内免疫细胞数量的调控，A-H阳性细胞呈棕色，阳性细胞被设计省去一抗(D)，或被同种型抗体染色(E)， I表示阳性染色细胞数量，*表示？<0.05，与未致敏组相比。
具体实施方式
试剂
磁珠抗体(Miltenyi Biotec， Auburn， CA, USA)， iScriptTMcDNA合成试剂盒(Bio-Rad， Mississauga, ON, Canada), Superscript III Platinum SYBR Green Two-StepqPCR Kit (Invitrogen, , ON, Canada), Oligo Fectamine and siRNAs (Invitrogen， Burlington, ON, Canada), ELISA kits (R&D Systems, Burlington, ON, Canada), Anti-IL-4、 anti-IFN-y、 anti-TGF陽卩、anti-IL-10 (BD Bioscience, Mississauga, ON, Canada), [3H] thymidine (GE Healthcare, Piscataway, NJ， US A) ， ProteoExtract subcellular proteome extraction kit (Calbiochem， San Diego， CA)，本发明中的其它试剂均购自 Sigma Aldrich (Oakville, ON, Canada)。 小鼠
6-8周龄的Balb/c小鼠购自Charles River Canada (St. Constant, QC， Canada),饲 养在无菌的环境中。
实施例l鼠李糖乳杆菌Pr2肽的纯化
1、 累积证据表明益生菌的应用对免疫功能具有调节作用，例如，修复失衡的 Thl/Th2功能，提高Tregs的产生等。因为活的细菌是获得治疗作用所必须的，本发 明的发明人推测在益生菌培养上清液中的一种成分可能起调控DCs功能的作用，并 进一步调控免疫反应。本发明的发明人用骨髓来源树突状细胞(BMDCs)作为评价 体系，用鼠李糖乳杆菌培养上清液沉淀物用来刺激BMDCs的生长。既然DCs来源 的IL-IO和转化生长因子(TGF-(3)在Tregs产生中具有关键作用，因此，本发明的 发明人对经鼠李糖乳杆菌培养上清液沉淀物刺激后的BMDCs培养过程中这两种分 子进行了评价。
鼠李糖乳杆菌(X. i /^mmw叫'ATCC; Manassas, VA, USA，为本领域公知公用的标 准菌株)在MLR肉汤培养基中37°C培养24 h，洗涤后，细胞进一步在MLR9中培 养96h。离心去除细胞，疏水作用色谱法纯化上清液中蛋白，经旋转蒸发后，阳离子 交换色谱法收集蛋白，然后，细菌素部分经SepPakC18反相柱脱盐后，经高压液相 色谱法纯化，收集峰值物质分成几个部分。
参照文献报道分离获得BMDCs;培养第7天，通过磁珠分选技术(MACS)分 离0011^细胞(纯度>95%);根据不同分组分别加入不同浓度的上述获得的上清液 沉淀物(兔IgG设为对照)，37°C培养48小时。结果显示初始BMDCs表达少量IL-IO。 上清液沉淀物在mRNA水平和蛋白质水平均使BMDC表达IL-10增加，而且呈剂量 依赖性(图，1 A-C)。在细胞提取液中可检测到TGF-P，其表达水平在经上清液沉 淀物刺激后无变化(图，1C)。把上清液沉淀物分成几组成分，再分别用这些成分刺 激BMDCs生长，最终， 一种肽-Pr2被鉴定为是刺激BMDCs增加IL-10表达的主要 因子，其氨基酸序列见图1D。
2、 鼠李糖乳杆菌Pr2肽的纯化
8鼠李糖乳杆菌在MLR肉汤培养基中37°C培养12 h，洗涤后，细胞进一步在 MLR9中培养96h。离心去除细胞，疏水作用色谱法纯化上清液中蛋白，经旋转蒸发 后，阳离子交换色谱法收集蛋白，然后，细菌素部分经SepPakC18反相柱脱盐后， 经高压液相色谱法纯化，收集峰值物质分成几个部分。
分离获得BMDCs;培养第7天，通过磁珠分选技术(MACS)分离0011^细 胞(纯度>95%);根据不同分组分别加入不同浓度的上述获得的上清液沉淀物(兔 IgG设为对照)，37。C培养48小时。结果显示初始BMDCs表达少量IL-lO。上清液 沉淀物在mRNA水平和蛋白质水平均使BMDC表达IL-10增加，而且呈剂量依赖性。 把上清液沉淀物分成几组成分，再分别用这些成分刺激BMDCs生长，鉴定出一种肽 -Pr2是剌激BMDCs增加IL-10表达的主要因子。 3、鼠李糖乳杆菌Pr2肽的纯化
鼠李糖乳杆菌在MLR肉汤培养基中37°C培养48 h，洗涤后，细胞进一步在 MLR9中培养96h。离心去除细胞，疏水作用色谱法纯化上清液中蛋白，经旋转蒸发 后，阳离子交换色谱法收集蛋白，然后，细菌素部分经SepPakC18反相柱脱盐后， 经高压液相色谱法纯化，收集峰值物质分成几个部分。
分离获得BMDCs;培养第7天，通过磁珠分选技术(MACS)分离001化+细 胞(纯度>95%);根据不同分组分别加入不同浓度的上述获得的上清液沉淀物(兔 IgG设为对照)，37。C培养48小时。结果显示初始BMDCs表达少量IL-lO。上清液 沉淀物在mRNA水平和蛋白质水平均使BMDC表达IL-10增加，而且呈剂量依赖性。 把上清液沉淀物分成几组成分，再分别用这些成分刺激BMDCs生长，鉴定出一种肽 -Pr2是刺激BMDCs增加IL-10表达的主要因子。
实施例2鼠李糖乳杆菌Pr2肽的功能检测
1、 Pr2在增加BMDCs表达IL-lO中的作用。
经Pr2刺激后，培养液和BMDCs细胞提取液中的IL-10表达水平比经上清液沉 淀物刺激后的表达水平明显增加(图，1A， B)，且呈剂量依赖性(图1 E， F)。对 BMDCs中IL-10表达进行动态观测，连续观察研究显示Pr2增加IL-10的表达在第 12小时达高峰，并且保持高水平于观察全程(96小时)(图1G)。
2、在上述Pr2介导的BMDCs表达IL-10过程中是否有Stat3的参与
有研究显示Stat3可能在IL-10表达中起重要作用。本发明的发明人也研究了在 上述Pr2介导的BMDCs表达IL-10过程中是否有Stat3的参与。BMDCs与不同剂量 等级的Pr2共培养24h，核提取物中均可检测出Stat3和磷酸Stat3。经Pr2刺激后，Stat3的水平改变无意义(图2A)，而磷酸Stat3表达水平呈剂量依赖性方式增加(图 2B)。结果表明Pr2能够增加BMDCs中Stat3的磷酸化。而且，通过染色质免疫沉淀 法测定(ChIP)显示，经Pr2处理后，能够增加IL-10基因的转录(图2C, 2D)。为确定 Stat3在经Pr2刺激后的BMDCs表达IL-10中的作用，通过RNA干扰技术，使一组 BMDCs中的Stat3基因沉默，Stat3基因沉默后，Pr2刺激BMDCs表达IL-10增加 的作用消失(图2C, 2D)。 DCs来源的IL-10在Tregs产生中起关键作用，结果显示Pr2 刺激DCs产生的是"耐受性的"DCs且是有潜在的Tregs诱导剂。
3、 Pr2具有在体外促进耐受性的DCs产生的功能 本发明的发明人证明了 Pr2具有在体外促进耐受性的DCs产生的功能，是否
Pr2在体内也有同样的作用？通过腹腔注射(i.p，2mg/kg)或灌胃(4mg/kg)的方式 给予Balb/c小鼠Pr2，每天1次，共5天，最后一次给予后3天后，处死小鼠。在脾 和肠组织中，纯化的CDllc+中IL-10+细胞的比率与对照组未处理鼠相比明显提高， 见图2E-J。
4、 与Pr2冲击的DCs共培养可增加CD4+T细胞表达Foxp3 通过试剂盒从鼠的脾脏中分离CD4+CD25T细胞(纯度>95%);在IL-2存在的
情况下把这种初始的T细胞和Pr2刺激后的BMDC共同培养0-4周期(1周期表示 共同培养72h， CD4+T细胞通过MACS被纯化，然后，加入新鲜的Pr2冲击的BMDCs 共同培养)。流式细胞仪检测结果显示该处理明显增加CD4+CD25+T细胞中Foxp3 表达，并呈一种处理周期数相关性(图3A，和B)。在培养2周期后Foxp3表达量明 显增加；4个周期后后，超过60%的细胞表达Foxp3 (图3C-G)。结果表明Pr2冲击 的BMDCs具有使初始CD4+CD25T细胞转变为CD4+CD25+ Foxp3+Treg的功能。在 另一个独立的实验中，CD4+CD25T细胞加入到Pr2和OVA共同冲击后的BMDCs 中共同培养4轮， 一个有代表性的试验结果是纯化的CD4+CD25+T细胞中，有95.6% 的Foxp3+T细胞(图3H)。在Pr2冲击的BMDCs增加CD4+T细胞表达Foxp3过程 中，IL-10可能是主要的因子， 一组CD4+CD25T细胞用抗IL-10受体抗体预处理后， 再和Pr2冲击的BMDCs共同培养，结果显示未出现Foxp3的表达增加(图3B 11)。 我们用流式细胞仪也检测了这些细胞中IL-4和INF-Y的表达量，结果显示，和初始 CD4+CD25T细胞相比，差异无统计学意义。
5、 重新暴露于特异性抗原OVA时，OVA特异性诱导的Treg (OVA-iTreg)中 IL-10 、 TGF- e和Fasl表达量增加。把产生的OVA-iTreg (比率〉95%)暴露于不同剂量梯度的OVA中。ELISA结 果显示上清液中的IL-10高表达(图4A)和Fasl高表达(图4B)， TGF-e未能检测 出。然而，qRT-PCR结果显示IL-IO、 TGF-e和FaslmRNA表达水平在分离的 OVA-iTreg中表达量增加，呈OVA剂量依赖性(图4C)。 western blot测定显示IL-IO、 TGF-e和Fasl在细胞提取液中蛋白质表达量增加(图4D)。流式细胞计数显示TGF-e和Fasl在OVA-iTreg细胞表面的表达情况(图4E-F)。结果表明重新暴露于特异 性抗原时，IL-IO、 TGF-p和FasL在Tregs中的表达是增加的，IL-IO、 FasL可被释 放到微环境中，而TGF-(3只能表达在Tregs表面。
6、 产生的Tregs具有肠道归巢特性。
western blot结果显示产生的Tregs细胞表达CCR9分子(图5 A)， CCR9在Tregs
肠道归巢中是一个染色质受体标记。研究发现这种Tregs具有肠道归巢特性，我们用 CFSE对这种Tregs进行染色，并把它通过尾静脉注射入未致敏的小鼠体内。 一天后 处死小鼠，肠道组织通过共聚焦显微镜观察，CFSE染色标记过的细胞位于肠道固有 层组织内(图5B)，这一结果表明转入小鼠体内的Tregs能够在一天内归巢到小肠组 织内。
7、 活化的抗原特异性的Tregs能够抑制肠道内的超敏反应
如图4描述，OVA-iTregs中IL-IO、 TGF-P和Fasl表达增加。体外研究表明， 可能活化的抗原特异性Tregs具有抑制机体内过激的Th2反应能力。为验证这一推测， 建立了OVA抗原特异性的肠道过敏小鼠模型。血液样本经面静脉穿刺取得。血清中 OVA特异性IgE^ 100 ng/ml的Balb/c小鼠经尾静脉将被过继转移入OVA-iTreg (4x 108/kg)。转入一天后，小鼠将被灌胃给OVA(2g/kg)，每天1次，共5次。最后一次 灌胃一天后处死小鼠。血清OVA特异性IgE水平(图6A) 、 IL-4/IFN-y水平(图6B) 和OVA特异性肠道CD4+T细胞增殖(图7C)、肥大细胞脱颗粒(图.6D-G)、肠道内 IL-4+和Foxp3+细胞数量(图7)，将作为过敏参数来评价其治疗作用。结果显示 OVA-iTregs能够显著抑制肠道内过敏反应。Pr2单独刺激后的BMDCs组显示能够削 弱肠道内过敏反应，未处理组小鼠和OVA单独刺激后组对肠道内过敏反应无抑制作 用。
为阐明是否Pr2在体内能够提高Tregs的产生，Pr2(2mg/kg)和/或OVA (0.8 mg/kg)将同过腹腔注射或灌胃的方式给予OVA致敏的Balb/c小鼠(血清中OVA特 异性IgE^100ng/m)，每天1次，共5次。最后一次处理后，小鼠将给予OVA(2g/kg)
11共3天。结果显示致敏小鼠肠道中的过敏反应(参数包括OVA特异性IgE、 IL-4、 IFN-Y、 OVA特异性T细胞反应和肥大细胞活性))经给予Pr2和OVA后消除，致 敏小鼠肠道中的过敏反应在单独给予Pr2后减轻，而单独给予OVA后致敏小鼠肠道 中的过敏反应未减轻。序列表
<110>郑鹏远杨平常
<120> —种鼠李糖乳杆菌Pr2肽及其编码基因、分离方法和应用 <160>2
<210>1
<211>66
<212>PRT
<213>鼠李糖乳杆菌(L. Rhamnosus) <400> 1
AIFPWLVVDG QGSRLPSANV廳LLTTIQML YVERFPREVG AVTDYDVKYE MFGA道GTK 60
ENEAFA 66 <210>2 <211>198 <212>DNA
<213>鼠李糖乳杆菌(L.Rhamnosus) <400> 2
gcgatttttc cgtggctggt ggtggatggc cagggcagcc gcctgccgag cgcgaacgtg 60 atgaacctgc. tgaccaccat tcagatgctg tatgtggaac gctttccgcg cgaagtgggc 120
gcggtgaccg attatgatgt gaaatatgaa atgtttggcg cgaaaattcg cggcaccaaa 180
gaaaacgaag cgtttgcg 98
权利要求
1、一种鼠李糖乳杆菌Pr2肽，其特征在于，具有如SEQ No.1所示的氨基酸序列。
2、 编码权利要求1所述鼠李糖乳杆菌Pr2肽的基因。
3、 如权利要求2所述的基因，其特征在于，具有如SEQ Na2所示的核苷酸序列。
4、 分离权利要求l所述鼠李糖乳杆菌Pr2肽的方法，其特征在于，包括以下步骤1) 鼠李糖乳杆菌在MLR肉汤培养基中37°C培养12—48h，洗涤后，细胞进 一步在MLR9中培养96h;2) 离心去除细胞，疏水作用色谱法纯化上清液中蛋白，经旋转蒸发后，阳离子 交换色谱法收集蛋白；3) 收集的蛋白部分经SepPakC18反相柱脱盐后，经高压液相色谱法纯化；以及4) 收集有功能的部分。
5、 权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Pr2肽在制备用于治疗食物过敏性疾病的药 物中应用。
全文摘要
本发明涉及免疫医学领域，具体地，本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌Pr2肽及其编码基因、分离方法和应用。根据本发明的鼠李糖乳杆菌Pr2肽，其具有如SEQ No.1所示的氨基酸序列。鼠李糖乳杆菌来源的Pr2肽具有体外刺激产生Tregs的能力。同时暴露于Pr2和抗原能够产生抗原特异性Tregs，这种抗原特异性Tregs能够在再次暴露于特异性抗原时被激活。激活后的抗原特异性Tregs释放功能性分子IL-10、TGF-β和FasL。过继转移抗原特异性Tregs或给予致敏小鼠Pr2和特异性抗原能够明显抑制机体中抗原特异性Th2反应和过敏反应，从而这种方法在治疗食物过敏性疾病中具有潜在的应用价值。
文档编号C07K14/195GK101456904SQ20081011095
公开日2009年6月17日 申请日期2008年6月18日 优先权日2008年6月18日
发明者杨平常, 郑鹏远 申请人:郑鹏远;杨平常