一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖及其制备方法和应用。该胞外多糖由质量分数比为45.13～47.80％的葡萄糖、35.26～36.17％的鼠李糖和16.94～18.70％的半乳糖组成，该胞外多糖由式I所示重复结构单元组成，该胞外多糖的平均重量分子量为98万～147万道尔顿，其为一种组成明确，具备一定免疫调节作用的新型多糖，可作为添加剂应用于制药、临床等领域中，应用前景十分广阔。
【专利说明】_种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖及其制备方法和应用
[0001] 本申请要求申请日为2013年12月27日的中国专利申请CN201310743058. 0的优 先权。本申请引用该中国专利申请的全文。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)的胞外多糖及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0003] 乳酸菌（Lactic acid bacteria)是一类能利用可发酵性糖产生大量乳酸的细菌 总称，目前在自然界已发现的这类细菌在分类学上至少有23个属。在食品、医药等领域应 用较多的乳酸菌主要有乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属 等。乳酸菌是益生菌最主要的来源，许多乳酸菌是人体肠道固有的益生菌，具有改善人体肠 道菌群，调节机体免疫力，抑肿瘤，降低血清胆固醇，调节血压等重要的生理活性。
[0004] 乳酸菌发挥主要功能特性的作用机理，除了定殖、通过主要代谢产物（乳酸等）改 善肠道内环境等以外，一些次生代谢产物如细菌素、胞外多糖等也发挥着非常重要的作用。 其中，具有理论和实际应用价值的乳酸菌胞外多糖引起了国内外许多学者的研宄兴趣。
[0005] 乳酸菌胞外多糖是乳酸菌产生并分泌到细胞外的一种多糖。乳酸菌胞外多糖具有 重要的工艺学功能，对酸乳、干酪及绝大多数发酵乳制品的流变性质、质构、口感以及风味 具有重要的影响。乳酸菌胞外多糖可以改善乳制品的流变学特性和质构特性。由于天然增 稠作用，由产粘乳杆菌与非产粘球菌混合发酵形成的酸乳与非产粘菌株形成的酸乳相比口 感滑润、粘度增加；产胞外多糖乳酸菌能够赋予酸乳更强的持水力，从而避免乳清析出；此 夕卜，由胞外多糖而产生的持水性增强有助于提高干酪等产品的得率。乳酸菌胞外多糖还具 有良好的生理功能，如增强黏膜吸附作用、抗肿瘤、抗溃疡、免疫调节、降胆固醇、降血压，还 可以作为益生元促进肠道内其他益生菌的生长，优化肠道微生态环境等。因此，开展产胞外 多糖乳酸菌的研宄，对于改善乳制品生产加工、开发具有特定功能性质的乳酸菌发酵乳制 品，具有十分重要的研宄意义和经济价值。开发具有益生功能的乳酸菌胞外多糖成为目前 研宄的热点。
[0006] 20世纪60年代以来，多糖被认为是一种广谱的非特异性的免疫促进剂，可增强宿 主细胞的细胞免疫和体液免疫功能，如激活巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等，激活补体 及诱导产生干扰素等，其作用将是激活人体的非特异性防御机能，在抗病毒、抗肿瘤、抗辐 射等方面有很好的疗效。
[0007] 然而，目前在本领域内，研宄成熟的并且能够在实践中推广应用的乳酸菌胞外多 糖的种类并不多，生产和科研上都存在对新的胞外多糖进行研宄的需要，以丰富性能优良、 用途广泛的乳酸菌胞外多糖的种类。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是针对目前乳酸菌胞外多糖种类和产品功能不够丰 富的现状，而提供一种新的乳酸菌胞外多糖，具体为一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖，本发明 还提供所述胞外多糖的制备方法和应用。本发明的胞外多糖被证明具有良好的有丝分裂原 活性和免疫调节活性。
[0009] 本发明所述的鼠李糖乳杆菌的胞外多糖最初发现由保藏编号为CGMCC No. 6430的 鼠李糖乳杆菌所产生。所述的保藏编号为CGMCC No. 6430的鼠李糖乳杆菌筛选自健康成 年人的粪便，在发酵乳中能够产生胞外多糖。本发明人在研宄中发现该菌株具有良好的耐 酸耐胆盐性能，其具有潜在的益生功能，并且体外细胞实验发现其粗多糖可以提高小鼠 T/B 淋巴细胞的活性，其具有潜在的提高机体免疫力的功能。为了更好地了解其结构和功能，对 其粗多糖进行分离纯化及其功能研宄。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心（简称CGMCC)保藏，其保藏编号为CGMCC No. 6430。在此基础上，本发明提供下述 技术方案。
[0010] 本发明提供的技术方案之一是：一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖，所述胞外多糖由 质量分数比为45. 13?47. 80%的葡萄糖、35. 26?36. 17%的鼠李糖和16. 94?18. 70% 的半乳糖组成，该胞外多糖由式I所示的重复结构单元组成，
[0011] -1)_α-D-葡萄糖（2- l)-a-L-鼠李糖（3 -l)-a-L-鼠李糖（3-1)-(接 下行）
[0012] a -L-鼠李糖（3 - 1) - β -D-葡萄糖（3 - 1) - β -D-半乳糖（3 -
[0013]
【权利要求】
1. 一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖由质量分数比为 45. 13?47. 80%的葡萄糖、35. 26?36. 17%的鼠李糖和16. 94?18. 70%的半乳糖组成， 该胞外多糖由式I所示的重复结构单元组成，
该胞外多糖的平均重量分子量为98万?147万道尔顿。
2. 如权利要求1所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖由保藏号为CGMCC NO. 6430的鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus)菌株所产生。
3. -种如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括 如下步骤： (1) 将保藏编号为CGMCCNo. 6430的鼠李糖乳杆菌的种子液以体积比1. 0?5. 0%的 接种量接种于无菌脱脂乳培养基，于28?36°C培养24?40小时得发酵液； (2) 将步骤（1)所得的发酵液在95?100°C加热10?30min，冷却至15?25°C后静 置3?16小时，离心取上清并向所述上清中加入三氯乙酸溶液至终浓度为5?8%，静置 8?16小时，离心获得发酵上清液；所述百分比为每100毫升中含有的三氯乙酸的克数，所 述三氯乙酸溶液是质量百分数为75?85%的三氯乙酸溶液； (3) 向步骤（2)所得的发酵上清液中加入2?4倍体积的体积百分数为80?100%的 乙醇，离心或过滤收集沉淀物并将沉淀物溶于水，用截留分子量为5000?14000道尔顿的 透析袋在水中透析48?72小时，每8?12小时换水一次，在温度不超过105°C下干燥或者 真空冷冻干燥，即得所述胞外多糖的粗品。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，所述的无菌脱脂乳培养基 是将10?12重量份脱脂乳和0. 8?1. 2重量份葡萄糖溶解于85?90重量份的水中，于 115?125°C灭菌15?20分钟，冷却至15?25°C所得的无菌脱脂乳培养基；所述的接种 量是2. 0?4. 0%，发酵的时间是24?36小时。
5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，所述的接种量是2.0? 2. 5%，发酵的时间是28?32小时。
6. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中，所述的加热为将步骤（1) 所得的发酵液在95?100°C加热15?20min;所述的三氯乙酸的质量百分数为78?82%。
7. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)中，所述的乙醇的体积百分数 为82?90% ;所述透析袋的截留分子量为12000?14000道尔顿。
8. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其还包括步骤（4):所述的步骤（4)为： 采用离子交换层析柱对步骤（3)所得的胞外多糖的粗品进行分离纯化，依次以45?55mM， pH7. 5 ?7. 8 的Tris-HCl缓冲液和含 0? 2 ?1. 2MNaCl的 45 ?55mM，pH7. 5 ?7. 8 的 Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，洗脱速度为2. 5?3. 5mL/min，合并收集第二个组分峰 的洗脱产物，装入截留分子量为10000?15000道尔顿的透析袋在去离子水透析中48?72 小时，每8?12小时换水一次，在温度不超过105°C下干燥或者真空冷冻干燥，即得所述胞 外多糖。
9. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤⑷为：采用 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱对步骤（3)所得的胞外多糖的粗品进行分离纯 化，所述离子交换层析柱的规格为D2.6cmX30cm，依次以50mM，pH7. 6的Tris-HCl缓冲 液和含0. 5?1. 0M NaCl的50mM，pH7. 6的Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，洗脱速度 为3mL/min，合并收集第二个组分峰的洗脱产物，装入截留分子量为14000道尔顿的透析袋 在去离子水透析中72小时，每8小时换水一次，在温度不超过105°C下干燥或者真空冷冻干 燥，即得所述胞外多糖。
10. 如权利要求1所述的胞外多糖在食品、医药和相关领域的应用。
【文档编号】A23L1/09GK104479043SQ201410842673
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】吴正钧, 郭本恒, 韩瑨, 邵丽, 杭锋, 刘振民 申请人:光明乳业股份有限公司