专利名称：一种高效安全的植物表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于转基因植物技术领域，具体是涉及一种高效安全的植物表达载体。
背景技术：
粮食问题是社会和谐、稳定的重要物质基础，是每个国家关心的核心问题之一。解决粮食安全问题是保障国民经济高效和可持续发展的必要前提。近几年，随着环境的恶化、 耕地面积的减少、人口的增长，中国的粮食问题面临着越来越大的挑战。单纯依靠传统的育种方法已经不能解决越来越严峻的形势，转基因技术是现代生物技术的核心，利用转基因技术生产优质、多抗、高效、多产的作物新品种，是缓解资源束缚、保护环境安全以及拓展农业功能的重要途径。发展和完善现有转基因技术具有重要的实际应用价值。自1983年首例转基因植物培育成功，转基因技术得到了广泛应用。现在转基因植物已扩展到包括经济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、水果、树木以及牧草等在内的 35个属、120多个物种。但是随着转基因作物商品化生产的加快，一些潜在的问题逐步浮现出来，其中转化效率低是植物转基因技术存在的一个主要问题，农杆菌的侵染能力是影响转化效率的一个因素，一般来说农杆菌的侵染能力越强，植物的转化效率越高，但是农杆菌的毒性太强会影响转化植物的存活率，因此寻找一个具有强的侵染能力并高存活率的转化载体一直转基因技术领域探索的热点问题；另外，外源基因的沉默和外源基因的表达量低是转基因技术领域普遍存在的问题，外源基因的侵入会引起植物自身防御系统的反应，使外源基因发生沉默，抑制外源基因的表达，这样使得外源基因的表达效率降低最终导致目的性状植物的获得具有比较高的难度；转基因的安全性问题也是现代人普遍关注和讨论的问题，在转基因的实际操作过程中利用农杆菌介导、基因枪等方法将外源基因转入到植物体内，一般来说，在LB和RB之间的片段能够整合到植物基因组中，这段片段中包含启动子和目标性状等对获得目标转基因必需的遗传物质，但在很多情况下，由于农杆菌具有的高侵染能力，整合到植物基因组上的不止LB和RB之间的必要遗传物质，在LB后面的一部分骨架序列也会整合到植物基因组中，为转基因植物的安全性带来不必要的风险。本发明人通过漫长而艰苦的实验，提出了一种安全高效的植物表达载体，该表达载体含有一段核质结合序列、VirG结构区域和双LB结构，核质结合序列能够对外源基因的沉默起到抑制作用，virG结构区域增强基因的转录，双LB结构能抑制载体骨架的整合，该载体的转化效率和外源基因的表达效率都得到了提高，安全性也明显提升。因此，具有很大的实际应用价值和市场推广前景。
发明内容
本发明针对现代植物转基因技术领域的不足，构建了一种高效、安全的新型表达载体H(T17，该载体含有一个表达盒，依次包括RB序列、核质结合序列(Mar)、遗传物质、核质结合序列(Mar)、双LB序列，virG结构序列。本发明所述的Mar序列如SEQ ID NO=I所示，在植物转基因过程中本发明提供的表达盒的MAR序列能够抑制外源基因的沉默，提高外源基因表达的稳定性和表达效率。本发明所述的双LB序列如SEQ ID NO :2所示，在植物转基因过程中本发明提供的表达盒的双LB能够减少载体骨架整合到基因组的概率，增加转基因的安全性。本发明所述的VirG结构序列如SEQ ID NO :3所示，在植物转基因过程中本发明提供的表达盒的VirG结构是一种突变了的VirG结构，能够增加农杆菌的侵染活性，提高 T-DNA转化效率。本发明提供了一种高效、安全的新型植物表达载体H(T17，显然本领域的技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
附图1 PKT17载体图谱。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。具体步骤可参见《Molecular Cloning: A Laboratory Manual)) (Sambrook, J. , Russell, David W. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。实施例1 :PKT17的构建
根据SEQ ID NO :1命名为MAR基因序列，设计引物时引入酶切位点1，设计引物1和引物2，用引物1和引物2进行PCR扩增，然后酶切，得到插入片段；取pCAMBIA1303 (购自 Cambia公司)用同样的酶切，然后用连接酶连接上述插入片段和载体，转化大肠杆菌DH5 α 菌株，经含有50mg/L卡那霉素的2 X YT培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序插入无误后得到引入mar序列的H(T17的前体PPKT17。根据SEQ ID N0:2命名为双LB序列，设计引物时引入酶切位点2，设计引物3 和引物4，用引物3和引物4进行PCR扩增，然后酶切，得到插入片段；取上述PKT17的前体 PPKT17用同样的酶切，然后用连接酶连接上述插入片段和载体，转化大肠杆菌DH5 α菌株， 经含有50mg/L卡那霉素的2ΧΥΤ培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序插入无误后得到引入mar序列和双LB序列的H(T17的前体PPH(T17。根据SEQ ID NO 3命名为virG序列，设计引物时引入酶切位点1，设计引物5 和引物6，用引物5和引物6进行PCR扩增，然后酶切，得到插入片段；取PCAMBIA1303 (购自Cambia公司)用同样的酶酶切，然后用连接酶连接上述插入片段和载体，转化大肠杆菌 DH5a菌株，经含有50mg/L卡那霉素的2XYT培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序插入无误后得到H(T17。
权利要求
1.一种新型的能够提高外源基因稳定性和安全性的表达载体H(T17，该载体含有一个表达盒，依次包括RB序列、核质结合序列(Mar)、遗传物质、核质结合序列(Mar)、双LB序列，virG结构序列。
2.权利要求1所述的Mar序列是如SEQID NO=I所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的双LB序列是如SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的virG序列是如SEQID NO 3所示的核苷酸序列。
5.转化的植物细胞，其具有权利要求1所述的表达盒载体H(T17。
全文摘要
本发明针对现代植物转基因技术领域的不足，构建了一种高效、安全的新型表达载体PKT17，该载体含有一个表达盒，依次包括RB序列、核质结合序列(Mar)、遗传物质、核质结合序列(Mar)、双LB序列，virG结构序列。
文档编号C12N5/10GK102344935SQ20111010019
公开日2012年2月8日 申请日期2011年4月21日 优先权日2010年12月13日
发明者刘军华, 夏勉, 张斌 申请人:北京未名凯拓作物设计中心有限公司