一种植物组成型油酸表达载体及其构建方法和转化油菜的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其设及一种植物组成型油酸表达载体及其构建方 法，和该载体转化油菜的方法。
【背景技术】
[0002] 油菜度rassicanapusL.)是植物油和植物蛋白的主要来源之一，占我国油料 作物总产量的40%~45%。油菜可分为白菜型油菜度rassicacampestris)、芥菜型油 菜度rassicajuncea)和甘蓝型油菜度rassicanapusL.)Ξ大类型：。甘蓝型油菜 度rassicanapusL.，AACC化=38)是由芸臺（AA化=20)和甘蓝度rassicaOlercea， CC化=18)通过自然种间杂交后自然加倍进化而来的一个复合种，我们通常栽培用的就 是甘蓝型油菜。
[0003] 乌柏[Sapiumsebiferum化.）Roxb.]属大戟科乌柏属多年生高大落叶乔木，与油 茶、油桐、核桃合称为我国四大木本油料树种。其种子既含油又含脂，乌柏梓油中富含油酸、 亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸，含量占总脂肪酸的90%左右，单位面积乌柏油脂产量高 于油茶、油桐，也高于号称"油王"的油栋。因此，乌柏曾被日本科学家誉为"绿色原子弹"。
[0004] PDAT是一种不依赖于酷基CoA的多功能酶，具有底物专一性，WDAG为酷基的受 体，将憐脂上的脂酷基转移给sn-1，2-DAG，促进TAG合成。并与真核生物中膜脂成分的变化 密切相关，酵母和维管植物的PDAT存在于内质网中。还有一些植物的PDAT定位于叶绿体， 在内质网中并未检测到相关的信号肤。除酵母外，在向日葵、藍麻子等油料作物的微粒体中 也克隆到了PDAT基因，但在乌柏中该基因还未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种植物组成型油酸表达载体及其构建方法，该表达 载体克隆了乌柏中的油脂积累相关基因PDAT，能够高效表达油酸。
[0006] 本发明所述的植物组成型油酸表达载体含有SsPDATl基因，所述SsPDATl基因 是乌柏中促进油脂积累的关键酶基因，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。优选该表达 载体含有35S启动子驱动绿色巧光蛋白基因GFP和SsPDATl基因形成的融合基因，即 35S: :GFP-SsPDATl。采用的原始连接载体为祀GAD载体。
[0007] 所述的植物组成型油酸表达载体的构建方法，包括W下步骤：
[000引 （1)W乌柏cDNA为模板，通过引物进行PCR扩增；其中，所述引物为：
[0009] 沈QIDNO:2 :5> -CCGGAATTCATGCCTTTMTTCGCCGGAAGAAAC-3>，
[0010] 沈QIDNO:3 :5' -CGCGGATCCTTACAGCGGCAAGTTGATCTTCTCA-3' ；
[0011] (2)将步骤（1)中的PCR扩增产物克隆到pUCm-T载体中，经测序鉴定后，用EC0R I和BamHI双酶切pUCm-T载体和祀GAD载体，分别回收小片段和大片段，然后进行连接； 阳01引 做将步骤似得到的连接产物转化大肠杆菌D册α，经抗生素筛选获得阳性克 隆；提取阳性克隆的质粒，得到植物组成型油酸表达载体。
[0013] 本发明的目的之二是提供上述植物组成型油酸表达载体转化油菜的方法。旨在通 过所获得的植物组成型油酸表达载体构建一种油酸含量增加的油菜新品种。
[0014] 上述目的是通过W下方式实现的。
[0015] 一种植物组成型油酸表达载体转化油菜的方法，包括W下步骤：
[0016] (1)通过所述植物组成型油酸表达载体转化油菜植株；
[0017] (2)通过抗性筛选和RT-PCR鉴定得到获得转基因油菜；
[0018] (3)通过油脂含量测定验证转化成功。
[0019] 在步骤（1)中，所述转化采用农杆菌介导的转基因方法。具体是将所述植物组成 型油酸表达载体电击转化农杆菌GV3101，经100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素筛选获 得阳性克隆，再进行农杆菌介导的遗传转化。 W20] 上述步骤（1)更加具体的过程：挑取电击转化的农杆菌单菌落置于20ml含100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28 °C震荡培养24小时；将 菌液按1:100的比例稀释，取200μ1稀释菌液涂布新鲜的含100μg/ml利福平和50μg/ ml卡那霉素的YEB固体平板，28°C培养2~3天，用150血的抑5.8的含5 %薦糖、0. 05% 511巧6*-77、0.4%乙酷下香酬、0.002%。6-84的1/2 15液体培养基为转化液将培养皿中的 农杆菌洗脱下来，配置成0D600-0.8的农杆菌转化菌液；然后将去掉果芙和已开放花朵的 油菜花序轻轻伸入塑料袋，让转化菌液充分浸泡花序，时间为30秒；浸泡后的花序立即用 羊皮纸袋包扎；2~3天后按上述方法重复转化一次，同一花序共浸泡转化3次；在完成最 后一次转化的7天后，摘除花序上的羊皮纸袋；待种子成熟后，收获晒干，得到TO代转基因 种子。
[0021] 所述步骤（2)具体包括：
[0022] 对T1代幼苗进行Basta抗性筛选，获得的抗性幼苗实行单株收种；
[0023] 对T2代幼苗继续进行Basta抗性筛选，获得纯合子转基因株系；
[0024] 采用RT-PCR方法对获得的纯合子转基因株系进行鉴定，获得目的基因SsPDATl的 转基因纯合子株系。
[00巧]上述方法适用的油菜品种为甘蓝型油菜。
[00%] 本发明提供了一种植物组成型油酸表达载体及其构建方法，利用乌柏的油脂积累 相关基因SsPDATl，构建该基因的植物组成型表达载体，并将其转化甘蓝型油菜，通过抗性 筛选，RT-PCR鉴定和油酸含量测定等获得高油酸含量的的转基因油菜植株。分析发现，转 基因油菜植株的产量比野生型明显增加，即本发明通过遗传转化培育出了一个高油酸含量 的油菜新品种。
【附图说明】
[0027] 图1是本发明Ti类质粒祀GAD载体的T-DNA表达框的结构示意图；
[0028] 图2是本发明含SsPDATl基因的Ti类质粒祀GAD载体的T-DNA表达框的结构示 意图；其中，35S:CaMV35S启动子；SsPDATl:乌柏中编码油脂积累相关基因；Bar:Basta抗 性基因；GFP:绿色巧光蛋白基因；LB和RB:分别为T-DNA的左边界和右边界；MCS:多克隆 位点；EC0RI和BamHI:将SsPDATl基因构建在祀GAD载体上所用的酶切位点；
[0029] 图3是本发明转基因油菜中Bar基因的检测结果图巧ar基因是Basta筛选标记 基因；
[0030] 图4是本发明中高油酸含量油菜的半定量RT-PCR鉴定结果图； 阳03U 图5是本发明中转基因油菜的GFP-SsPDATl基因的检测； 阳03引图6是本发明高油酸含量油菜和野生型的脂肪酸比较图；其中，WT为野生型， 35S: :GFP-SsPDATl-l、35S: :GFP-SsPDATl-3 和 35S: :GFP-SsPDATl-7 为转基因油菜；横坐标 表示脂肪酸成分：16:0 (软脂酸）、18:0 (硬脂酸）、18:1 (油酸）、18:2 (亚油酸）、18 :3 (亚 麻酸）、20:0(花生酸）、22:0(山斋酸）。
【具体实施方式】
[0033] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0034] 实施例1高油酸含量油菜的制备
[0035] 1、SsPDATl基因克隆和35S: :GFP-SsPDATl表达载体的构建
[0036] SsPDATl是乌柏中的一个与油脂积累相关的基因，在NCBI中还没有该基因的相关 信息，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示。采用prime巧软件设计PCR引物，引物如下所示：
[0037]沈QIDNO:2 :5' -CCGGAATTCATGCCTTTMTTCGCCGGAAGAAAC-3'， 阳的8]沈Q ID NO :3 :5' -CGCGGATCCTTACAGCGGCAAGTTGATCTTCTCA-3'；
[0039] 上述两个引物划线部分为引入的EC0RI和BamHI酶切位点。W乌柏的cDNA为模 板，利用上述引物，进行PCR扩增。得到的PCR产物首先克隆到pUCm-T载体（购于上海生 共生物工程有限公司）中，经测序鉴定后，用EC0RI和BamHI双酶切pUCm-T载体和祀GAD 载体（购买于长沙市佳和生物科技有限责任公司）（图1)，分别回收小片段和大片段，然后 进行连接。连接产物转化大肠杆菌D册α，经抗生素（50μg/ml卡那霉素）筛选获得阳性克 隆。提取阳性克隆的质粒，得到35S: :GFP-SsPDATl表达载体，即本发明的植物组成型油酸 表达载体（图2)。 W40] 2、油菜的转化
[0041] 根据BI0-RAD电击转化仪说明书将35S: :GFP-SsPDATl表达载体电击转化农杆菌 GV3101，经抗生素（100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素）筛选获得阳性克隆。挑取单 菌落置20mlLB液体培养基中（含100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素），28°C震荡 培养24小时。将菌液按1:100的比例稀释，取200μ1稀释菌液涂布新鲜的含抗生素（含 100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素）的ΥΕΒ固体平板，28°C培养2~3天，用150血的 转化液（含5%薦糖、0.05%Silwet-77、0.4%乙酷下香酬、0. 002%。6-BA的1/2MS液体培 养基，P册.8)将培养皿中的农杆菌洗脱下来，配置成0D600-0.8的农杆菌转化菌液。将转化 菌液装入塑料袋中，然后将去掉果芙和已开放花朵的油菜花序抓成一束，轻轻伸入塑料袋， 让转化菌液充分浸泡花序，时间为30秒。浸泡后的花序立即用羊皮纸袋包扎。2~3天后 按上述方法重复转化一次，同一花序共浸泡转化3次。在完成最后一次转化的7天后，摘除 花序上的羊皮纸袋。待种子成熟后，收获晒干，得到TO代转基因种子。
[0042] 3、转基因油菜植株的筛选
[0043] 将高油酸含量TO代转基因油菜种子播种在±壤中，在幼苗期按1:1000 (v/v)喷施 Basta，每隔2~3天喷施一次，连续喷4~5次。当Basta的油菜的主枝和部分侧枝现蕾 并有几朵小花开放时，用羊皮纸袋包扎，W避免杂交。种子成熟后，对其进行单株收种，得到 T1代种子，晒干后保存于-20°C备用。对T2代幼苗继续用Basta筛选，不再发生抗性分离的 株系为纯合子转基因株系。将本发明实施例得到的转基因油菜