一种鸡传染性法氏囊病毒复合亚单位疫苗制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及兽用生物制品技术领域，具体设及一种鸡传染性法氏囊病毒复合亚单 位疫苗制备方法。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性法氏囊病（Infectiousbursaldisease,IBD)是由传染性法氏囊病毒 (Infectiousbursaldiseasevirus,I抓V)引起的危害鸡的一种急性、高度接触性传染 病。该病主要感染3~12周龄的青年鸡，主要侵害淋己组织，特别是法氏囊，IBDV能在法 氏囊B淋己细胞中迅速繁殖，引起法氏囊B淋己细胞的损伤，造成免疫抑制，从而增加对其 它疫病的易感性。目前IBD已成为危害世界养禽业的Ξ大主要传染病之一，我国是禽类养 殖生产大国，生产规模居世界第一位。近年来由于IBDV超强毒株、变异株的流行，抗原变异 和血清亚型的多样性，使传统的疫苗已不能控制其流行性。因此开发更为有效、安全的新型 疫苗已成为迫切的需要。
[0003] 目前市场上广泛使用的法氏囊疫苗有法氏囊的全病毒灭活疫苗和基因工程疫苗， 法氏囊的全病毒灭活疫苗使用传染性法氏囊病毒株适应细胞制备，基因工程疫苗采用大肠 杆菌表达传染性法氏囊病毒VP2基因制备。运两种疫苗可W产生一定的免疫保护效果，但 是，由于IBDV在野外环境中的变异能力很强，每年均有超强毒力的IBDV野毒出现，很可能 突破现有的疫苗保护，出现疫苗保护性下降的情况。因此针对鸡传染性法氏囊病的发病趋 势，现在主要是分离和筛选免疫原性好的、适应细胞繁殖种毒的超强流行毒株进行疫苗制 备，运样需要对不断出现的IBD流行毒株进行分析和防控，增加了对IBDV防治工作的繁重 性。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种鸡传染性法氏囊病毒复合亚单位 疫苗制备方法，W解决现有技术中相关疫苗对不同病毒变种的通用性较差的技术问题。
[0005] 本发明要解决的另一技术问题是现有技术的相关疫苗对IBDV免疫效力较差。
[0006] 为实现W上技术目的，本发明采用W下技术方案：
[0007] 一种鸡传染性法氏囊病毒复合亚单位疫苗制备方法，包括W下步骤：
[0008] 1)取序列如SEQIDN01所示的基因片段，将其连接到线性表达载体祀T-22b上， 得到祀T-22b-N-VP2质粒，将祀T-22b-N-VP2质粒转化大肠杆菌B21，得到重组菌；
[0009]。培养步骤1)得到的重组菌，而后向培养液中加入终浓度为0.ImM的IPTG， 25°C、220rfm摇化，离屯、收集菌体；
[0010] 3)将步骤2)所述菌体重悬于PBS缓冲液中超声破碎，离屯、收集上清，即得到粗蛋 白溶液； W11] 4)将步骤扣得到的粗蛋白溶液用Ni柱纯化，PBS透析，即得到N-VP2蛋白抗原溶 液；
[0012] 5)培养鸡传染性法氏囊病毒，得到病毒培养液而后浓缩、灭活，即得到病毒抗原溶 液；
[0013] 6)取步骤4)制备的N-VP2蛋白抗原溶液、步骤5)制备的病毒抗原溶液混匀，向其 中加入4% (v/v)的Tween80,溶解即得到疫苗水相，再取疫苗油相制备疫苗。
[0014] 优选的，步骤1)中将序列如SEQIDN01所示的基因片段连接到线性表达载体 pET-22b上时，所选的酶切位点是化0I和化0I。
[0015] 优选的，步骤2)加入诱导剂前，培养液的ODe。。数值为0. 6~0. 8。
[0016] 优选的，步骤3)中用于重悬菌体的PBS缓冲液，其体积是所述菌体的1/20。
[0017] 优选的，步骤3)离屯、收集上清后，再次超声破碎，离屯、收集上清，即得到粗蛋白溶 液。 阳01引优选的，步骤4)所述N-VP2蛋白抗原溶液中N-VP2蛋白浓度为500ug/mL。
[0019] 优选的，步骤5)所述病毒抗原溶液中鸡传染性法氏囊病毒效价 > 1〇7'5tCID5〇/0.ImL。
[0020] 优选的，步骤6)中N-VP2蛋白抗原溶液和病毒抗原溶液w1:1 (v/v)比例混合。
[0021] 优选的，步骤5)所述灭活的方法是：向浓缩后的病毒培养液中加入甲醒至甲醒终 浓度为 1. 5%。（v/v)，37°C灭活 20h。
[0022] 优选的，步骤6)中疫苗水相和疫苗油相的用量比为1:3 (v/v)。
[0023] 本发明主要针对IBDV在野外环境中变异能力很强，变异株和超强毒株不断出现 的情况，提供一种免疫原性好、通用性好的鸡传染性法氏囊病毒复合亚单位疫苗的制备方 法。据研究表明VP2是IBDV的主要结构蛋白，位于病毒粒子的外表面，占病毒总结构蛋白 的51%，是病毒主要的宿主保护性抗原，VP2基因Ng2 417端的366bp的基因序列是VP2基因 的保守序列，不同毒株间差异不大，对IBDV的保护具有良好的通用性和免疫原性。N-VP2与 IBDV灭活全病毒共同制备复合亚单位疫苗降低了IBDV全病毒灭活疫苗制备的成本，N-VP2 蛋白具有良好的免疫原性和通用性，与IBDV灭活病毒协同作用，能够提高鸡体内的抗体水 平、抗体产生快，提高鸡对IBDV免疫的通用性，能够抵抗不断突变的IBDV的侵袭。
[0024] 本发明方法的技术优势主要体现在W下方面：
[0025] (1)本发明合成的N-VP2序列为IBDVVP2蛋白的保守序列，具有良好的免疫原性， 对IDBV的防治具有通用性，可W有效预防不断出现的IBDV变异株的侵袭。 阳0%] (2)本发明采用的祀T-2化表达载体含有信号肤，可W将N-VP2蛋白导入到周质 腔，表达的祀T-22b-N-VP2蛋白为可溶性蛋白，具有天然的N-VP2蛋白的抗原活性，生产成 本低，表达量大，与法氏囊灭活病毒制备复合亚单位疫苗可W降低灭活疫苗的生产成本，又 突破了VP2亚单位疫苗的保护局限性。
[0027] (3)本发明采用了本±分离的具有较强免疫原性的鸡传染性法氏囊病毒，免疫原 性好，保护率高。
[0028] (4)本发明制备的复合亚单位疫苗使免疫后鸡第一周即产生特异性抗体，抗体产 生快，抗体水平高，攻毒保护率提高，进一步提高免疫效果。
【附图说明】
[0029] 图1是正常鸡法氏囊形态图。
[0030] 图2是本发明实施例中对鸡攻击BC6-85强毒后，其法氏囊形态图，图中可见法氏 囊肿大、有粘液。
[0031] 图3是本发明实施例中对鸡攻击BC6-85强毒后，其法氏囊形态图，图中可见法氏 囊萎缩。
[0032] 图4是本发明实施例中对鸡攻击BC6-85强毒后，其法氏囊形态图，图中可见法氏 囊发黄。
【具体实施方式】
[0033] W下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 W下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0034] W下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准 确数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的 范围内变化，比如，"大约100"表示的可W是90到110之间的任何数值。此外，在"大约第 一数值到第二数值"的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近 似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0035] 除有定义外，W下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。
[0036] W下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法；W下实施例中的定量试验，均设置Ξ次重复实验，结果 取平均值；W下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。 阳〇37] 实施例1
[0038] 一种鸡传染性法氏囊病毒复合亚单位疫苗的制备方法，包括W下工艺步骤：
[0039] 1)N-VP2蛋白的表达与纯化；
[0040] 2)鸡传染性法氏囊病毒抗原液制备与灭活；
[0041] 3)鸡传染性法氏囊病毒复合亚单位疫苗的制备：将步骤1)得到的N-VP2蛋白与 步骤2)得到的鸡传染性法氏囊病抗原液按1 : 1的比例混合后添加4%的TweenSO,再与 熬制好的Marcol52进口白油按1 : 3比例（w/w)乳化制备复合亚单位疫苗。
[0042] 其中，步骤DN-VP2蛋白的表达与纯化包括W下步骤： 阳0创 （1)表达载体的构建将优化合成的VP2基因Ns2 417端的366bp的N-VP2序列（具 体如SEQIDN01所示）亚克隆到线性表达载体祀T-2化上，酶切位点为化0I、化0I，新 质粒命名为祀T-22b-N-VP2,转化E.coli.BL21，并对重组菌进行测序鉴定。
[0044] (2)大肠杆菌中的表达过程挑取化21/PET-2化-N-VP2单菌落，接种Amp(lOOug/ mL)LB液体培养基中，37°C震摇培养过夜。将培养好的菌液按照1:100接种至含有 Amp(lOOug/mL)LB液体培养基，37°C摇床培养至ODe。。到0. 6-0. 8 (大约2.化后可达到），加 诱导剂终浓度为0.ImM，25°C、摇化后，800化化离屯、lOmin得到菌体，加PBS混悬后 进行超声波破碎，离屯、收集上清。
[0045] (3)蛋白的纯化制备的可溶性蛋白用Ni柱进行纯化，PBS进行透析，将透析后 pET-22b-N-VP2 蛋白稀释到 500ug/mL。
[0046] 步骤2)鸡传染性法氏囊病毒抗原液制备与灭活包括W下步骤：
[0047] (1)种细胞的传代与培养鸡胚传代细胞系DF1细胞系经膜酶细胞分散液消化传 代，W细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒。
[0048] (2)病毒接种当细胞长满单层时，按细胞悬液1%的比例接种本实验室分离、鉴定 的鸡传染性法氏囊病毒强毒山东株（SD)，控制溫度在37°C。
[0049] (3)病毒收获当DF1细胞出现80%W上病变时，反复冻融3次，得到含上清液的细 胞毒液。
[0050] (4)病毒效价测定按照中华人民共和国兽药典规定的半数感染量测定方法，进行 病毒含量测定，该病毒的效价应> 1〇7'5tCIDw/〇.ImL。
[0051] (5)病毒的灭活将检测合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入甲醒溶液充分摇匀， 甲醒溶液的加入量为病毒液体积的0. 5%。-2%。，37°C灭活12-4化，转速为18化/min。
[0052] (6)病毒的灭活检验将灭活后的病毒进行10 2稀释后按5%接毒量接种已长成良 好单层的鸡胚传代细胞系DF1细胞，观察96h，应不出现细胞病变，并再盲传1代，观察96h， 若不出现细胞病变，则判定为灭活完全。 阳〇5引实施例2
[0054] 2. 1 N-VP2蛋白的表达与纯化 W55] (1)将优化合成的VP2基因Ns2 417端的36化P的N-VP2序列（具体如SEQID N01所示）亚克隆到线性表达载体祀T-22b上，酶切位点为化0I、化0I，新质粒命名为pET-22b-N-VP2,转化E.coli.BL21，并对重组菌进行测序鉴定。
[0056] (2)