枸杞番茄红素ε-环化酶基因及包括该基因的重组载体的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种枸杞番茄红素ε -环化酶基因及包括该基因的重组载体，
具体为枸紀(Zyci.chinense Miller)中番前红素ε -环化酶基因ZfflLcyE的克隆。
【背景技术】
[0002]番茄红素的环化反应是是植物体内胡萝卜素生物合成途径重要的分支点。番茄红素ε -环化酶(Lycopene ε -cyclase, LcyE)，能催化番前红素的一端形成δ-环，生成δ -胡萝卜素。
[0003]类胡萝卜素是C4。的碳氢化合物，广泛存在于植物、一些光合细菌以及藻类中的脂溶性色素，主要包括胡萝卜素(carotenes)和它们的氧化衍生物叶黄素(xanthophylls)两大类。类胡萝卜素在植物光合作用中起着至关重要的作用，它们是光合天线和光反应中心复合体不可缺少的结构成分，还可以保护叶绿素免受强光导致的光氧化破坏。类胡萝卜素是维生素A的前体，具有增强免疫、抗氧化、增进细胞缝间联接交流、预防、延缓及治疗癌症的功能。Aluru等将细菌crtB ipds)和crtl基因串联在一起，在玉米胚乳中特异性表达，胚乳中类胡萝卜素含量提高34倍，并积累了大量的维生素A的前体:β -胡萝卜素。
[0004]生物系统中一旦形成高度活泼的具有损伤能力的自由基后，就会对细胞遗传物质和细胞膜进行强烈的破坏，导致细胞功能下降，机体衰老以及疾病的发生。类胡萝卜素，尤其是胡萝卜素能抑制、清除体内自由基，可以延缓衰老和预防肿瘤、血栓、动脉粥样硬化等疾病。类胡萝卜素能增加免疫系统中Β细胞的活力、消灭外源入侵的病原菌，能提高淋巴辅助Τ细胞的活力，协助Β细胞产生抗体，并提高其他免疫组分的活性；还能增加自然杀伤细胞的数目，以消除机体内被感染的细胞或癌细胞。据报道，除胡萝卜素外，番茄红素等也有增加免疫力的功能。
[0005]随着人类对类胡萝卜素药用价值及医疗保健作用的不断发现，对类胡萝卜素的种类和产量的需求也将越来越大，然而，类胡萝卜素很难用化学方法合成。现代分子生物学研究手段的发展，使得类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键酶的基因被陆续分离鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产类胡萝卜素开辟了道路，特别是通过类胡萝卜素基因工程获得“金色水稻”和“金油菜”，极大地增强了人们开展植物类胡萝卜素基因工程的?目心。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种枸杞番茄红素ε -环化酶基因及包括该基因的重组载体。通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3’ RACE技术克隆了枸杞番茄红素ε-环化酶基因ZMxyE，得到完整的基因序列为1569。构建了大肠杆菌表达载体pET28a_ZMxyE，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因McyE编码的酶活性进行了鉴定，枸杞番茄红素环化酶基因McyE能够催化番茄红素环化为δ胡萝卜素，使代谢向下游流动，提高α-类胡萝卜素含量。
[0007]本发明的第二个目的是提供该枸杞番茄红素ε-环化酶基因编码的蛋白质。
[0008]本发明提供了一种枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE，如序列表SEQ ID N0.1中所示的核苷酸序列。
[0009]本发明提供了一种上述枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZicyE编码的蛋白质，如序列SEQ ID N0.1中所示的氨基酸序列。还包括该所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
[0010]本发明提供了一种上述枸杞番茄红素ε-环化酶基因ZMxyE重组克隆载体pMD18-T-ZfflLcyE0
[0011]含有上述的枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE的重组载体，这些重组载体包括质粒。所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-ZfflLcyE。
[0012]含有上述枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞。
[0013]本发明提供了一种番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE编码的蛋白在大肠杆菌中的表达应用。
[0014]本发明的克隆方法由下述步骤组成:
从枸杞叶片中提取总RNA，根据转录组Unigene序列中番茄红素ε -环化酶基因核苷酸序列设计上游引物 ZaLcyEF:5’-ATGGAATGTGTTGGAGTTCAAAA TT -3’，然后利用 3’ RACE 方法扩增得到完整的基因序列为1569bp。
[0015]本发明首次从枸杞中分离出编码番茄红素ε -环化酶的完整cDNA。
[0016]本发明构建含番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE的大肠杆菌表达载体pET28a_ZfflLcyE，包括下述步骤:
1)构建含有枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZicyE的中间载体pMD18-T_ZicyE:
设计由序列SEQ ID N0.3所示的上游引物F1，和由序列SEQ ID N0.4所示的下游引物R1，以枸杞番茄红素ε -环化酶基因的cDNA为模板，PCR扩增，将PCR扩增产物连接于PMD18-T载体，获得含有序列SEQ ID N0.1所示的枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZicyE的中间载体 pMD18-T_LfflLcyE。
[0017]2)构建大肠杆菌表达载体pET28a-Z?LcyE:
设计由序列SEQ ID N0.5所示的上游引物F2，和由序列SEQ ID N0.6所示的下游引物R2 (其中F2 5’端带有Noel酶切位点的碱基，R2 5’端带有ZAol酶切位点的碱基)，以质粒pMD18-T-ZicyE为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经Abel和ZAol酶切后，将大肠杆菌表达载体pET28a经Abel和ZAol酶切，二者进行连接反应，得到大肠杆菌表达载体pET28a-ZfflLcyE0
[0018]本发明提供了一种枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用，首次从枸杞中分离出编码枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE的完整cDNA，连接到大肠杆菌表达载体上，利用外源表达系统验证枸杞ZicyE基因在蛋白水平表达的产物具有酶的活性。
[0019]本发明所述的枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE可望用于制备转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜植株。
[0020]本发明通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3’ RACE技术克隆了枸杞番茄红素ε-环化酶基因ZMxyE，得到完整的基因序列为1569bp。构建了大肠杆菌表达载体pET28a_ZicyE，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞番茄红素ε -环化酶基因McyE编码的酶活性进行了鉴定，枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZicyE能够催化番茄红素环化，使代谢向下游流动，提高α-类胡萝卜素含量。
【附图说明】
[0021]图1 为 pMD18-T_LfflLcyE 载体示意图。
[0022]图2为pET28a_ZfflLcyE载体示意图。
[0023]图3为pET28a_ZfflLcyE酶切验证结果。
[0024]图4为ZfflLcyE在大肠杆菌中的表达。
[0025]
【具体实施方式】
[0026]实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]实施例1
枸杞番茄红素ε -环化酶基因McyE的克隆:
以 RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN，German)试剂盒，从 lOOmg 新鲜枸紀叶片(宁夏枸f己)中提取Total RNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物，ZfflLcyE基因上游引物为:LaLcyEF:5'-ATGGAATGTGTTGGAGTTCAAAATT -3’。利用 3’ -FULL RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa，Japan)试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤:①以Total RNA为模板，使用3’RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成1st Strand cDNA，反应体系如下:
RNA:2 μ 1
3’ RACE Adaptor:1 μ 1
5XM-MLV Buffer:2μ1
dNTP Mixture:1 μ 1
RNase Inhibitor:0.25 μ 1
Reverse Transcriptase M-MLV:0.25 μ 1
RNase Free ddH20:3.5 μ 1
反应条件:42°C，60min ;70°C，15min。
[0028]②根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物3’ RACE out primer，以1stStrand cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下:
1st PCR 产物:2μ1
dNTP Mixture:8 μ 1
LnLcjEF:2 μ 1
3’ RACE out primer:2 μ 1
10XLA PCR Buffer I1:4μ1 MgCl2:3 μ 1
TaKaRa LA Taq:0.25 μ 1
ddH20:28.75 μ 1
反应条件:94°C，3min ；94°C,30sec ；55°C,30sec ；72°C, 2min30sec ；72°C, lOmin, 30 个循环。
[0029]实施例2
克隆载体pMD-18-ZicyE的构建过程
将序列表所示的LmLnLcfi基因与pMD_18载体连接，反应体系如下:
目的PCR片段:4 μ 1
pMD-18 载体:1 μ 1
Solut1nI:5 μ 1
反应条件:16°C，30min。连接产物转化E-Col1.T0P10，涂布于含氨苄的LB平板。以目的基因为引物进行 PCR(反应条件:94°C，3min ;94°C，30sec ;54°C，30sec ;72°C，2min30sec ；72°C，10min，30个循环。)得到PCR产物，电泳条带正确，然后送华大基因测序公司测序，测序结果在NCBI中进行Blast，表明为该基因。
[0030]实施例3
大肠杆菌表达载体pET28a-ZMxyE的构建过程
首先，以pMD-18-ZicyE为模版，以序列SEQ ID N0.5所示的上游引物F2，序列SEQ IDN0.6所示的下游引物R2为引物扩增ZMxyE片段，其反应体系为:ddH2018.25 μ 1
Taq-plus react1n Buffer2.5 μ 1
dNTP2.0 μ 1
Primer F20.5 μ 1
Primer R20.5 μ 1
Template1 μ 1
Enzyme0.25 μ 1
反应条件为 94°C，4min ;94°C，30sec ;55°C，30sec ;72°C，2min ;72 °C，lOmin，30 个循环。PCR产物与pET28a质粒分别经Abel和ZAol双酶切，将二者酶切产物连接，反应体系为:
5 X Τ4 buffer2 μ 1
pET28a (酶切纯化后)5 μ 1
ZaLcyE (酶切纯化后)1 μ 1
Τ4 Enzyme1 μ 1
ddH201 μ 1
反应条件为16°C，16hrs。
[0031]连接产物转化E col1.ToplO，涂布于含Amp的LB平板。以目的基因为引物进行PCR得到1569bp产物，酶切鉴定得到目的条带，如图3为酶切电泳图。最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pET28a-ZMxyE构建正确。将构建好的植物表达载体pET28a-ZaLcyE转化大肠杆菌BL21。
[0032]实施例4
基因序列和蛋白序列:
ZfflLcyE基因在大肠杆菌中的功能验证
在大肠杆菌BL21 (DE3 )中共转化质粒pAC-LYC(氯霉素抗性)和表达载体pET28a -ZaLcyE(卡那霉素抗性)，具体步骤为:
A、向E.coli (BL21)感受态细胞中加入两种质粒DNA各1 yL，混匀，冰上放置30
min ；
B、42°C热激90 s，然后冰上放置2-3 min ；
C、加500yL，37 °C预热的LB液体培养基(不含抗生素)，37 °C，180 r/min振荡培养45 min ；
D、吸取50μ L上述培养液于含相应抗生素的LB固体培养基上，涂板；
Ε、倒置平板，37 °C，培养12hrs。枸杞番茄红素ε _环化酶基因ZMxyE编码的酶可使δ -胡萝卜素含量增加，表现为大肠杆菌菌落颜色由粉红变黄。如图4所示:Α为转化质粒pAC-LYC ；B为共转化质粒pAC-LYC和表达载体pET28a-ZicyE，可见菌落颜色由粉红色变化为黄色。LB液体培养基组成为:10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母提取物。
[0033]
序列表
<110>天津大学
〈120〉枸杞番茄红素ε-环化酶基因及包括该基因的重组载体 〈130〉 201322 〈160〉 6
<170> Patentln vers1n 3.3
〈210〉 1
〈211〉 1569
〈212〉 DNA
〈213〉人工系列
〈220〉
〈221〉 gene 〈222〉 (1)..(1569)
〈