专利名称：枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB及包括该基因的质粒的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB及含有该基因的质粒。
背景技术：
植物类胡萝卜素通过类异戊二烯途径合成。GGPP(牦牛儿基牦牛儿焦磷酸)是该途径的直接前体，2个GGPP在PSY(八氢番茄红素合成酶)作用下形成八氢番茄红素，八氢番茄红素经过连续的脱氢反应，形成链孢红素，番茄红素。番茄红素是类胡萝卜素进一步合成代谢的分枝点，在LycB(番茄红β-环化酶)作用下番茄红素环化形成β-胡萝卜素，在LycB(番茄红β-环化酶)和LycE(番茄红ε-环化酶)的共同作用下形成α-胡萝卜素，并进一步形成叶黄素等。随着分子生物学研究手段的发展，编码这些酶的基因已经从番茄、烟草、辣椒和拟南芥等植物中陆续分离鉴定。枸杞的总胡萝卜素含量为295.27mg/100g，其含量之高为植物所罕见。黄胡萝卜中总胡萝卜素含量也只有3.62mg/100g。枸杞类胡萝卜素合成酶基因的克隆还未见报道。主要技术文献有Cunningham FX，Gantt E.Genes andenzymes of carotenoid biosynthesis in plants.Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol，1998，6(49)557～583；Ji J，Yamamura S，Nixihala H.Study the role each crt.geneon biosynthesis of provitamin A(β-carotene)and lutein 2000，IBRC Report，20～21；陶俊，张上隆，徐昌杰，安新民，张良诚.类胡萝卜素合成的相关基因及基因工程.生物工程学报，2002，18(3)276～281；李忠，彭光华，张声华.枸杞子中的类胡萝卜素的组成及含量.植物资源与环境，1999，8(4)57～58等。
发明内容
本发明的目的是提供一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB。
本发明的第二个目的是提供一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB编码的多肽。
本发明的第三个目的是提供一种包含枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB的重组质粒pGEM-lblycB。
本发明的技术方案概述如下一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB，它具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
一种构杞类胡萝卜素合成酶基因lycB编码的多肽，它具有序列表SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。
一种包含权利要求1基因的重组质粒pGEM-lblycB，是以序列表SEQ ID No.3、SEQID No.4为引物PCR扩增出的DNA序列，回收得到1541bpDNA，将其克隆到pGEM-T载体上，构建了重组质粒pGEM-lblycB。
本发明参照其它植物的lycB基因序列设计引物，采用PCR技术从枸杞cDNA文库中分离到lycB基因，将其克隆到T载体，并采用生物信息软件对所获得的lycBcDNA及其推导的氨基酸序列进行分析。
本发明成功的获得枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB，为通过基因工程手段调控植物体内类胡萝卜素的代谢和积累，创造类胡萝卜素含量更高的品系，改良果蔬的营养品质，实现工厂化生产天然类胡萝卜素奠定基础。
图1为以从枸杞cDNA文库中提取到的λ噬菌体DNA为模板，SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4为引物的扩增产物凝胶电泳图谱，图中，1.PCR产物；2.Marker2000；图2为重组质粒pGEM-lblycB的PCR扩增鉴定，图中1.2 pGEM-lbLycB的PCR结果；3.Marker2000；图3为重组质粒pGEM-lblycB的酶切鉴定，图中1.Marker2000；2.3 pGEM-lbLycB的双酶切结果；图4为枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB序列的开放读码框分析。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1PCR模板的制备枸杞cDNA文库由本实验室提供，采用液体培养法提取λ噬菌体DNA。
本领域的技术人员都可以在实验室构建枸杞cDNA文库。该文库的构建步骤(1)总RNA提取及mRNA纯化；(2)cDNA双链的合成；(3)用连接酶将cDNA与接头连接；(4)去除小片段及多余接头；(5)将cDNA克隆到载体上；(6)噬菌体的包装；(7)cDNA文库质量检测。
在cDNA文库构建过程中，使用了mRNA分离试剂盒、cDNA合成试剂盒、LambdaDNA包装试剂盒、载体λExCell等，这些试剂盒均已经商品化。
实施例2PCR体外扩增根据柑桔、拟南芥、辣椒、番茄、烟草、黄水仙等LycB基因保守序列设计合成一对引物引物1(5′端引物SEQ ID No.3)5′-GGA TCC ATG GAT ACT TTA GTG AAA ACTCCA-3′；引物2(3′端引物SEQ ID No.4)5′-GC GGC CGC TTA TTC TTT GTC CCG CAATAA GTT-3′。在25μl反应体系中，加入10×PCR Buffer(Mg2+1SmM)2.5μl，dNTP(各2.5mmol/L)2μl，引物1(20μM)和引物2(20μM)各1μl，Ex TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，模板DNA 1.5ng。反应条件94℃ 3min→(94℃ 1min→59℃ 1min→72℃ 2min)35→72℃ 10min。扩增反应在德国UNOII Biometra DNA扩张仪上进行。反应结束后在1％琼脂糖凝胶上电泳检查。
实施例3扩增产物的克隆与DNA序列测定采用宝生物DNA片段回收试剂盒回收PCR扩增产物。回收产物在T 4DNA连接酶作用下与p GEM-T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109。在含氨苄青霉素的培养基上进行蓝白斑筛选。随机挑取白色菌落，用碱裂解法小量提取质粒DNA，并做PCR和双酶切(SacI，NcoI)鉴定。由华大基因上海鼎安生物科技有限公司用DNA荧光自动序列分析仪进行序列测定。
实施例4LycB基因序列分析对重组质粒pGEM-lbLycB进行的DNA序列分析结果表明，分离克隆的LycB基因cDNA全长1541bp(包含引物)，编码区1524bp，共编码508个氨基酸，其中A占28％，C占17％，G占23％，T占31％。将1541bp的核苷酸序列结果在NCBI服务器上用BLAST搜索软件进行同源性基因检索，结果发现该基因与柑桔(AF240787)、拟南芥(L40176)、辣椒(X86221)、番茄(X86452)、烟草(X81787)、黄水仙(X98796)LycB的同源性分别为87％，83％，81％，79％，78％，87％。该基因所推导的氨基酸序列与其它植物LycB的同源性高达70％-78％，肽链长度相仿，由498-508个氨基酸组成。
实施例5LycB基因所编码的蛋白质特性分析用Antheprot软件对lycB基因编码的蛋白质的基本特性和氨基酸组成进行分析。结果为，分子量(Molecular Weight)是57 230，等电点(Isoelectric Point)为8.205。在pH 7.0时，电荷为5.797。
表1 LycB基因编码的蛋白质氨基酸组成Table.1 The amino acid components by lycB
SEQ ID No.1ggatccatgg atactttagt gaaaactcca aataagcttg aatttctgca ccctttatgtgggtttgttg ataaagtctg ctcctttagc tgtctgaggt ctcataatca agaatacaataagtatttct tgaagaagtc tcatctgaaa acgggtagta aaaagggctt ttgtgttaaggctggaagta gcagtgctat tttggagctt gttcctgaaa ctaaaatgga gaatcttgaatttgagctcc cattatttga tcactcaaaa gggatagtcg ttgatttggc tattgttggtggtggtcctg ccggacttgc tgttgtacaa caggtttccg aggcggggct ttcggtttgttctattgatc catctccaaa actgatttgg ccaaacaatt atggtgtttg ggttgatgaatttgaggcca tggatttatt agattgcctt gatgctacat ggtctggagc agttgtatttatagacgacc ataaaagtaa agatctcgga aggccgtatg gaagggttaa taggaagcagttgaaatcta aaatgatgca aaaatgcata tcgaatggtg tgaagtttca taaagctaaagttgtgaaag ttactcacga ggaatcaaaa tcattagtaa tttgtaacga tggcgttact
attcaagctg ctgtggttct tgatgcaacc ggtttttcta gatgtttggt tcaatataataagccatata atcctggtta tcaggtggct tatgggattt tagctgaagt agaagaacacccttttgata taaacaagat ggttttcatg gattggcgcg attcacatct taacaataacacaaacctaa aggaaagaaa cagaaaggtg cccacctttc tttatgccat gccattttctaaagacaaaa tttttctaga agaaacgtcc cttgtagctc gtcccgggtt ggcaatagaagatatccaag agaggatggt tgctcgatta aggcacctcg gtataaaagt gaaatccatcgaagaagatg agcgttgtgt gattccaatg gggggtccac ttcctgtaat acctcagagagtagttggaa taggtggtac tgcaggaatg gttcatccat caactggtta tatggtagcaagaactcttg cagcagcacc cattgttgct aatgcgatag tgcgatatct tggttccgaaaagaggcatt taggtgctga gttatctggt gaagtttgga aagatttgtg gccaattgagaggagacgcc aaagggaatt cttctgtttt ggcatggata tattgcttaa gcttgatttagatgctttaa gaagattttt cgatgcattt tttgatttag agcctcgata ttggcatggattcttgtctt ctcggctatt tcttccagag ctggctttat ttgggctttc tcttttctctcatgctacca acacctcaag gcttgaaata atgtcaaaag gaacgcttcc tcttataaatatgataaaca acttattgcg ggacaaagaa taagcggccg cSEQ ID No.2MetAspThrLeu ValLysThrPro AsrLysLeuGlu PheLeuHisProLeuCysGlyPhe ValAspLysVal CysSerPheSer CysLeuArgSerHisAsnGlnGlu TyrAsnLysTyr PheLeuLysLys SerHisLeuLysThrGlySerLys LysGlyPheCys ValLysAlaGly SerSerSerAlaIleLeuGluLeu ValProGluThr LVsMetGluAsn LeuGluPheGluLeuProLeuPhe AspHisSerLys GlyIleValVal AspLeuAlaIleValGlyGlyGly ProAlaGlyLeu AlaValValGln GlnValSerGluAlaGlyLeuSer ValCysSerIle AspProSerPro LysLeuIleTrpProAsnAsnTyr GlyValTrpVal AspGluPheGlu AlaMetAspLeuLeuAspCysLeu AspAlaThrTrp SerGlyAlaVal ValPheIleAspAspHisLysSer LysAspLeuGly ArgProTyrGly ArgValAsnArgLysGlnLeuLys SerLysMetMet GlnLysCysIle SerAsnGlyValLysPheHisLys AlaLysValVal LysValThrHis GluGluSerLysSerLeuValIle CysAsnAspGly ValThrIleGln AlaAlaValValLeuAspAlaThr GlyPheSerArg CysLauValGln TyrAsnLysProTyrAsnProGly TyrGlnValAla TyrGlyIleLeu AlaGluValGluGluHisProPhe AspIleAsnLys MetValPheMet AspTrpArgAspSerHisLeuAsn AsnAsnThrAsn LeuLysGluArg AsnArgLysValProThrPheLeu TyrAlaMetPro PheSerLysAsp LysIlePheLeu
GluGluThrSer LeuValAlaArg ProGlyLeuAla IleGluAspIleGlnGluArgMet ValAlaArgLeu ArgHisLeuGly IleLysValLysSerIleGluGlu AspGluArgCys ValIleProMet GlyGlyProLeuProValIlePro GlnArgValVal GlyIleGlyGly ThrAlaGlyMetValHisProSer ThrGlyTyrMet ValAlaArgThr LeuAlaAlaAlaProIleValAla AsnAlaIleVal ArgTyrLeuGly SerGluLysArgHisLeuGlyAla GluLeuSerGly GluValTrpLys AspLeuTrpProIleGluArgArg ArgGlnArgGlu PhePheCysPhe GlyMetAspIleLeuLeuLysLeu AspLeuAspAla LeuArgArgPhe PheAspAlaPhePheAspLeuGlu ProArgTyrTrp HisGlyPheLeu SerSerArgLeuPheLeuProGlu LeuAlaLeuPhe GlyLeuSerLeu PheSerHisAlaThrAsnThrSer ArgLeuGluIle MetSerLysGly ThrLeuProLeuIleAsnMetIle AsnAsnLeuLeu ArgAspLysGluSEQ ID No.3Ggatccatgg atactttagt gaaaactcca 30SEQ IDNo.4Gcggccgctt attctttgtc ccgcaataag tt 3权利要求
1.一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB，其特征是它具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
2.一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB编码的多肽，其特征是它具有序列表SEQ IDNo.2所述的氨基酸序列。
3.一种包含权利要求1基因的重组质粒pGEM-lblycB，其特征是以序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物PCR扩增出的DNA序列，回收得到1541bpDNA，将其克隆到pGEM-T载体上，构建了重组质粒pGEM-lblycB。
全文摘要
本发明公开了一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB及包括该基因的质粒，枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列，本发明的枸杞类胡萝卜素合成酶基因lycB为通过基因工程手段调控植物体内类胡萝卜素的代谢和积累，创造类胡萝卜素含量更高的品系，改良果蔬的营养品质，实现工厂化生产天然类胡萝卜素奠定基础。
文档编号C12N15/63GK1884546SQ20061001448
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者季静, 王罡, 郑阳霞 申请人:天津大学