专利名称：编码杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的基因，具体地说涉及从杜氏盐藻(Dunaliellasaline)中分离的编码八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的新基因。
背景技术：
β-胡萝卜素在人体内是维生素A的前体，广泛用于食品、化妆品的添加剂及药品和保健品方面。目前市场上对β-胡萝卜素的需求主要通过三孢布拉霉发酵、从养殖的盐藻中直接提取以及化学合成满足，但仍然是供不应求。杜氏盐藻(Dunaliella salina)简称盐藻，是一种单细胞绿藻，能在适宜的条件下累积大量的β-胡萝卜素，其含量最高可超过干重的10％，是公认的产β-胡萝卜素最好的天然资源。八氢番茄红素是β-胡萝卜素合成途径中的前体物质，是第一个无色的类胡萝卜素分子。八氢番茄红素脱氢酶的功能是催化八氢番茄红素发生连续的脱氢反应，形成可以成环的番茄红素或其中间体，。
绿藻中，现已分离出该基因的物种有巴氏杜氏藻(Dunaliellabardawil)(GBAN Y14807)和雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)(GBAN X86783)，并且报道的只是该基因的mRNA序列。另外还报道了莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)PDS的EST序列发明内容本发明的目的在于提供从盐氏杜氏藻中分离获得的八氢番茄红素脱氢酶基因的cDNA序列。
本发明通过与盐藻亲缘关系较近的三种绿藻(Dunaliella bardawil，Haematococcus pluvialis；Chlamydomonas reinhardtii)和五种植物(Arabidopsis thaliana，zea mays，Lycopersicon esculentum，Capsicumannuum，Oryza sative)，以及噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)的八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的氨基酸序列进行对比分析，推测可能的保守区，在保守区的位置直接按照Dunaliella bardawil的核苷酸序列设计6条特异引物，利用RT-PCR的方法扩增出盐藻PDS cDNA的部分序列。进而通过RACE-PCR技术获得包括起始密码子的上游序列。
附图的简要说明
图1为本发明采用的RACE-PCR原理图。
发明的
具体实施例方式
通过与盐藻亲缘关系较近的两种绿藻(Dunaliella bardawil，Haematococcus pluvialis)和五种植物(Arabidopsis thaliana，zea mays，Lycopersicon esculentum，Capsicum annuum，Oryza sative)的八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的氨基酸序列进行对比分析，推测可能的保守区，在保守区的位置直接按照Dunaliella bardawil的核苷酸序列设计如下6条特异引物上游引物PDS921-F1，5’-CTTTGGTGCTTACCCCAACA-3’，PDS921-F2，5’-GAGCAGGATGAGCTGAC-3’，PDS921-F3，5’-TGGCGAAGGCCCTGAACT-3’；下游引物PDS921-R1，5’-GCAGGAAACGGTTCAGTG-3’PDS921-R2，5’-CTTCATGATGTCCACTGGCA-3’PDS921-R3，5’-TCACCCGCCAGGTAGAAG-3’。
从对数后期的盐藻中提取总RNA，用BD Clontech powerscript反转录酶合成单链cDNA作为PCR模板扩增出盐藻PDS cDNA的部分序列。反应程序为94℃预变性5min进入循环过程；94℃变性30sec，47℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环。最后以72℃延伸10min。经1％琼脂糖凝胶进行电泳分析。
取不同时间段培养的盐藻RNA进行如上反应。引物组合PDS921-F1/R2能扩增出一致性较好，特异性较强的一650bp的条带，凝胶回收后连接到pGEM-T easy(Promega)载体上，将重组质粒电转化到E.coli DH5α感受态细胞。对阳性克隆进行测序，并用BLAST程序对序列进行同源性分析。该片段与Dunaliella bardawil PDS的氨基酸和核苷酸序列的一致性分别达到92％和88％，初步确定它是的盐藻八氢番茄红素脱氢酶cDNA片段。
根据已知的该段序列设计了一条基因特异性下游引物(5’-GGGCTGGGATGTCTGGGAACTCAA-3’)进行5’-RACE。其原理是先是利用真核生物mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)18VN作为锁定引物在反转录酶PowerscriptMMLV反转录酶作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有寡核苷酸序列Oliogo(dG)的通用接头引物(5’-GGGTCTAGAGAATTCGGATCCAGGGGG-3’)配对后，转换为以该引物序列为模板继续延伸。用该引物序列作为上游引物，用上述的基因特异引物作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行降落PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。
经类似的克隆和测序后作BLAST分析，发现这段长394bp的5’末端cDNA序列包含起始密码子。将上述两段序列拼接后获得一段长1047bp的盐藻PDS cDNA序列。
PDS的基因序列如SEQ ID.1所示。
03序列~1SEQUENCE LISTING<110>华南理工大学<120>编码杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶的基因<130>200502<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1037<212>cDNA<213>杜氏盐藻(Dunaliella salina)<400>1atgcaggtta tgcaaggcag ggcacacgcg caggccgctt cttttaacag caagcctgtc 60cagcagaggc gcacgcagcg gaaagtaggc aggtcccgcc tgcaggtgta cgccagggat 120ttcccagctc ctcagttcga tggcacggag acgtaccagg aggccgtggc cctgtccaca 180aagctgcaaa atgccccccg gccagtaaag ccacagcgtg tcgtcattgc tggagccggc 240ctggctggcc tacccgctgc caagtacctt tctgaacgct ggccacatcc ccgtcgtgct 300ggaggcccgc gatgtgctgg ggggcaaggt ggccgcatgg aaggacgaag atggggactg 360gtatgagact ggcctgcaca tctttttcgg cgcatacccc aacatgcagc ggctgttcaa 420ggagctcaac atctctgaca ggttacagtg gaagagccac tctatgattt ttgccatgca 480agacaagcct ggagagttct cgccttttga gttcccagac atcccagccc catggaacgg 540tgtcattgcc atcctacgca acaatgagat gctgtcgtgg cctgagaaga tccagtttgc 600tgttggcctg ctgccggcca tcatcttcgg ccagaagtat gtggaagagc aggatgaact 660gacagtaact cagtggatgc agaagcaggg cgtgcccagc cgagtaaacg atgaggtctt 720cattgccatg gccaaggccc tcaacttcat caaccccgat gagctgtcca tgactgtcgt 780gctgacagcg ctgaaccgct tcttgcaaga gcgacatgga agcaagatgg cctttcttga 840tggtgctcct ccagagcgct tgtgccagcc catggtggac tacttcactt ccaggggtgg 900agagctaaag atgaacgcac gcatcaagca aatcgtgctc aatgaggaca acagcgtcaa 960gcacttcgag ctgctgaacg gagagattgt tgagggagat gcgtacatgt ctgcaatgcc 1020aggtggacat catgaag 103权利要求
1.一种分离的核苷酸，编码八氢番茄红素脱氢酶，其具有SEQ IDNO.1所示序列。
2.权利要求1所述的核苷酸，其特征在于其从杜氏盐藻中分离。
3.由权利要求1的核苷酸编码的氨基酸序列。
4.含有权利要求1所述核苷酸的表达载体。
5.含有权利要求1所述核苷酸的宿主细胞。
全文摘要
本发明提供从杜氏盐藻(Dunaliella salena)中分离的编码八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的新基因，为利用基因重组技术获得高效产β－胡萝卜素工程菌或是对天然盐藻进行生物改造以提高β－胡萝卜素的产量奠定基础。
文档编号C12N9/04GK1670212SQ200510033238
公开日2005年9月21日 申请日期2005年2月22日 优先权日2005年2月22日
发明者姜建国, 朱跃辉 申请人:华南理工大学