麻疯树八氢番茄红素合成酶基因序列及在植物中的应用的制作方法

专利名称：：麻疯树八氢番茄红素合成酶基因序列及在植物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学、基因工程
技术领域：
。具体地，本发明涉及一种在麻疯树中表达JcPSY蛋白(麻疯树八氢番茄红素合成酶，Jatrophacurcasphytoenesynthase,JcPSY)及其核酸序列。
背景技术：
：已知，β-胡萝卜素(β-Carotene)的生物合成主要发生于高等植物、藻类、真菌和细菌体内，动物体内不能从头合成β-胡萝卜素。β-胡萝卜素是维生素A(VitaminA)的前体，在人体内可根据需要转化为维生素Α。它具有营养、着色的双重作用，是联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)食品添加剂联合专家委员会认定的A类优秀有营养的食品添加剂(foodadditives)0近年来，越来越多的医学研究表明，胡萝卜素可抗多种癌症，特别是可降低肺癌发病率。胡萝卜素在淬灭自由基，增强人体免疫力，预防心血管疾病等保护人类健康方面起着重要的作用。番茄红素是类胡萝卜素中结构最为简单的主要色素，实验证明，番茄红素的摄入有利于降低前列腺癌的发病几率，保护心血管，降低紫外线对人类皮肤伤害等多种用途。八氢番茄红素合成酶是催化类胡萝卜素生物合成的一个特异性酶，它将两分子的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸(GGPP)催化合成第一个类胡萝卜素-八氢番茄红素。研究表明八氢番茄红素合成酶基因是类胡萝卜素生物合成途径中的限速酶，这在番茄果实中被证实。Fray等将番茄中的八氢番茄红素合成酶(PSY)基因反义导入番茄中，结果得到的转基因植株中类胡萝卜素含量显著降低(FrayRG，等。Constitutiveexpressionofafruitphytoenesynthasegeneintransgenictomatoescausesdwarfismbyredirectingmetabolitesfromthegibberellinpathway.PlantJ,1995,8(5):693-701)。在番茄、油菜、拟南芥和马铃薯中过量表达八氢番茄红素合成酶，相应组织中积累类胡萝卜素的水平显著提高，在番茄果实中胡萝卜素提高了1.9倍，拟南芥种子中平均提高43倍，油菜种子中提高50倍，马铃薯块茎中提高8倍。催化类胡萝卜素代谢途径第一步反应的八氢番茄红素合成酶PSY是这一代谢途径的关键调节酶，而由GGPP生成八氢番茄红素这一步骤已成为类胡萝卜素代谢途径的“瓶颈”。因此，PSY基因现已成为植物类胡萝卜素遗传工程中的首选目的基因(朱长甫，等.植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用.植物生理与分子生物学学报，2004，30(6):609-618)。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的编码麻疯树八氢番茄红素合成酶的cDNA序列。本发明中有关麻疯树八氢番茄红素基因的克隆以及功能研究受到国家自然科学基金(30771745)资助。
发明内容本发明的第一目的是提供一种新的麻疯树PSY基因，该基因是一个麻疯树PSY蛋白基因。本发明的第二目的是提供一种新的麻疯树PSY蛋白。本发明的第三目的是提供一种利用重组技术制备上述新的麻疯树PSY蛋白和核酸序列的方法。在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有麻疯树PSY蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1中从核苷酸第78-1364位DNA分子的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQIDNO.1中从核苷酸第78-1364位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.1中从核苷酸第78-1364位的核苷酸序列。在本发明的另一方面，提供了一种分离出的麻疯树PSY蛋白质多肽，它包括具有SEQIDNO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQIDN0.2序列的多肽。在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是酵母细胞、烟草和其它植物细胞。在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有麻疯树PSY蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下(1)将编码具有麻疯树PSY蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成麻疯树PSY蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1中从核苷酸第78-1364位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入原核宿主细胞，形成麻疯树PSY蛋白的重组细胞；(3)在适合表达麻疯树PSY蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有麻疯树PSY蛋白活性的基本纯的多肽。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQIDNO.1中第78-1364位的序列。在本发明的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有麻疯树PSY蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物中胡萝卜素的方法，其步骤如下(1)将编码具有麻疯树PSY蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含麻疯树PSY蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1中从核苷酸第78-1364位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在22-28°C条件下，暗培养1-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有麻疯树PSY蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含有麻疯树PSY蛋白基因的转基因植株中胡萝卜素显著提高。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQIDNo.1中第78-1364位的序列。本发明还提供了与PSY蛋白多肽特异性结合的抗体，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基木纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA、或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本发明中，术语“麻疯树八氢番茄红素合成酶(或多肽)编码序列”指编码具有麻疯树八氢番茄红素合成酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.1中第78-1364位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.1序列的编码框第78-1364位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.1中第78-1364位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQIDNO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQIDN0.1中从核苷酸第78-1364位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQIDNO.1中从核苷酸第78-1364位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的麻疯树PSY蛋白相同功能的蛋白的SEQIDN0.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20%，较佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。在本发明中，术语“麻疯树PSY蛋白或多肽”指具有麻疯树PSY蛋白活性的SEQIDNO.1序列的多肽。该术语还包括具有与天然麻疯树PSY蛋白相同功能的SEQIDN0.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括麻疯树PSY蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明的麻疯树PSY蛋白多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与麻疯树PSY蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用麻疯树PSY蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，“麻疯树PSY蛋白保守性变异多肽”指与SEQIDNO.1的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明还包括麻疯树PSY蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然PSY蛋白多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述的修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的麻疯树PSY蛋白多肽时，可以将麻疯树PSY蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成麻疯树PSY蛋白表达载体。如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。还可用Northern印迹法技术分析麻疯树PSY蛋白基因产物的表达，即分析麻疯树PSY蛋白的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。麻疯树PSYRNA的Northern印迹分析和麻疯树PSY特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实麻疯树PSY在生物样本中的表达。此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有麻疯树PSY蛋白核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码麻疯树PSY蛋白的核酸分子。本发明涉及检测样品中是否存在麻疯树PSY蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于麻疯树PSY蛋白核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的麻疯树PSY蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选麻疯树PSY蛋白同源基因或同源蛋白。为了得到与麻疯树PSY蛋白基因相关的麻疯树cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选麻疯树cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对麻疯树PSY蛋白的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自麻疯树的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，PaloAlto,Cal.。这种筛选方法可以识别与麻疯树PSY蛋白的基因家族的核苷酸序列。本发明的麻疯树PSY蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明麻疯树PSY蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变弓I入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而力口以生产(Stewart等人，(1969)Solid—PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco；MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149_2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的麻疯树PSY蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与麻疯树PSY蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。本发明的麻疯树PSY蛋白基因可通过基因工程技术用来提高植物中的β-胡萝卜素，用以提高植物的经济价值，本发明具有很大的应用前景。表2为本发明的麻疯树PSY与甜橙(Citrussinensis)PSY的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。表3为本发明的麻疯树PSY蛋白的氨基酸序列与番木瓜(Caricapapaya)PSY的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。表2gbIDQ235260.1CitrussinensisphytoenesynthasemRNA,completecdsLength=1311Score=989bits(535)，Expect=0.OIdentities=905/1083(83%),Gaps=27/1083(2%),Strand=Plus/PlusQuery253TTA-ATATAGATTTGAGGAATCCTTGTATAGGTAGTGGAAGCGAATTCCCTGTATTAGCA311IIIIIIlllllllllllllllIIIIIIIIIlNilIIlSbjct202TTAGATACAGATTTGAGGCATCCTTG-CT-CAT-CTGGAATCGACTTGCCTGAAATATCA258Query312AGTATGATTGCCAGTC-CAGCTGGAGAAATGGCTATCTCGTCAGAGGAGAA-GGTATACA369IIIIlllIlIIlllllllIlllIlIlIIIIlIlIIIIIISbjct259TGTATGGTTGCTAG-CACTGCTGGAGAAGTGGCCATGTCTTCAGAAGA-AATGGTTTACA316Query370ATGTGGTGATGAAGCAGGCAGCTTTGGTTAAAAAGCAATTAA——GGTCTAATCAAGAT425IlllIIIιlllllllllllllllllmillIlIIIIlIlIlSbjct317ATGTTGTGCTCAAGCAGGCAGCCTTGGTTAATAAGCAACCAAGTGGGGT-TACTCGTGAT375Query426CTTGATGTGAAACCAGATATTG-TTCTTCCAGGAAATCTGAGTTTGTTGAGTGAAGCTTA484lllllllllllllllllIlIIlIlllIIIIIIlIlllllllllSbjct376CTTGATGTGAACCCAGATATTGCTT-TACCCGGAACTTTAAGTCTGCTCAGTGAAGCTTA434Query485CGATAGATGTGGAGAAGTTTGTGCTGAGTATGCAAAAACATTTTACTTGGGAACTTTGCT544IIIιllllllllllllIlΜΙΝΙIllllllllllllllllllllllSbjct435TGATCGTTGTGGAGAAGTTTGCGCCGAGTATGCTAAGACATTTTACTTGGGAACTTTGCT494Query545GATGACTTCTGAAAGAAGAAGAGCTATCTGGGCAATATATGTGTGGTGTCGCAGGACTGA604IlllllΜΜΜIIIIIIIIIlllllllllllllllllIIIISbjct495GATGACCTCTGMAGGCGMGGGCTATATGGGCTATATATGTGTGGTGTAGGAGGACAGA554Query605TGAGCTTGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACGCCAACAGCTTTAGATAGGTGGGA664IlllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllSbjct555TGAGCTCGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACTCCAACAGCTTTAGACAGGTGGGA614Query665GGCAAGGTTGGAAGACCTTTTCCGAGGTCGTCCATTTGATATGTTTGATGCTGCTTTATC724IIllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllIIISbjct615GTCCAGGTTGGAAGACCTTTTCCGGGGTCGTCCATTTGATATGCTTGATGCTGCATTATC674Query725AGACACGGTTACTAAATTTCCTGTTGACATTCAGCCATTCAAAGATGTGATTGAAGGAAT784IIIIlIlIlIlIlIIIIlIlllllllllllllllllIlllNillllllllSbjct675AGATACAGTAACCAAATTTCCTGTCGACATTCAGCCATTCAGAGATATGATAGAAGGAAT734Query785GAGGCTGGACCTGAAGAAAACAAGATATAAGAACTTTGATGAGCTT-TATCTT-TACTGT842MMlllllllIIIIlllllllIlNNNNNIIlIlIIIIlIlSbjct735GAGGATGGACCTTAGGAAGTCAAGATACAAAAACTTTGATGAA-TTATA-CTTGTATTGT792Query843TATTATGTTGCTGGGACGGTTGGATTGATGAGTGTTCCGGTCATGGGCATTGCACCTGAA902IlIlIlIIIIlIlIlIlIlIlIIIlIIIIlIlIIllllllllllllllllSbjct793TATTATGTTGCTGGGACCGTAGGGCTAATGAGTGTTCCAGTTATGGGCATAGCACCTGAC852Query903TCACAGGCACCAACTGAGAGCGTCTATAATGCTGCCTTGGCATTAGGAATAGCAAATCAG962lllllllIlllIlIIIIlIlIlIIIIlMillIlllIlIlMillSbjct853TCACAGGCAACAACAGAGAGCGTCTACAATGCAGCATTGGCACTAGGGATTGCTAATCAG912Query963CTTACCMCATACTCAGGGATGTGGGAGAGGATGCMGMGAGGMGGATTTATTTACCA1022ΜIlIIIIlIlIlIlIIIIlIlIlIIIIlIlIlIIIIlIlIIIIIISbjct913CTCACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAGGATGCCCAAGAGGAAGGGTTTATCTACCA972Query1023CMGATGAGCTOGTGCAGGCTGGACTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGGMAG-TGAC1081lllllllIIIIIIl111111111111111111111111IIlIIISbjct973CAAGATGAGTTGGCACAGGCAGGGCTTTCAGATGATGACATATTTGCTGG-AGAGGTGAC1031Query1082AGAT-MATGGAGMATITTATGMGAGTCMATTMGAGGGCMGGATGTTCTTCMTG1140IllllllllllIllllllll111111111111111111111111Sbjct1032C-ATTMATGGAGMACTTCATGMGMCCMATTMGAGGGCMGGATGTTCTTTGAT-1089Query1141A"GGCAGAGMAGGAGTGACOGAGTTGAGTGCOGCMGTAGATGGCOGGTATGGGCATCT1199IIIIMMIllllllllMillIlllllllllllllllllllSbjct1090ATGGCTGAGMOGGTGTGACOGAGCTGAGTGMGCTAGTOGATGGCOGGTATGGGCTTCA1149Query1200TTAGM-TTATATCAGAAMTTCTAGATGAGATAGAAGCCAATGATTACAATAACTTCAC1258IlIIlIlIIMilIlllllllllIllllllllllllllllllllSbjct1150TT"GCTGTTGTACOGGCMATACTGGATGAGATTGAGGCCMTGATTACMCMCTTCAC1208Query1259MAGAGAGCATATGTMGCMAGCCMGMGTTAGCTTCTTTACCMTTGCATATGCMG1318lllllllIIIIlllllllllllIIIIllllllllllllllllSbjct1209MAGAGAGCTTATGTGAGTMAGCCMGMGATAGCTGCACTACCMTTGCATATGCAM1268Query1319ATC1321IISbjct1269ATC1271Query麻疯树JcPSY蛋白的核酸序列Sbjct甜橙CsPSY蛋白的核酸序列(GenBankAccessionNo.DQ235260)表3gbIABG72805.11phytoenesynthaseprotein(Caricapapaya)Length=438Score=715bits(1846),Expect=0·0,Method:Compositionalmatrixadjust.Identities=349/435(80%),Positives=384/435(88%),Gaps=7/435(1%)Query1MTVALLWVATPSTEASNSFGFLHSVR——VLDSSKVGSLDRNLTFKGRAKKGRSQKWKS56M+VALWVA+S+ESNSFGFS+R+DSS++GSDR+LFRAKKGRSQ+Sbjct1MSVALFWVASTSSELSNSFGFFDSLRDGNRLFDSSRLGSRDRSLFFSSRAKKGRSQRLNP60Query57SSVNIDLRNPC—IGSGSEFPVLASMIASPAGEMAISSEEKVYNWMKQAALVKKQLRSN114S+DLRCSP++SM+SPAGEMAISSEEKVYNVV++QAALVK+QLRS+Sbjct61GSICTDLRLGCSNFDGQSNMPLTSSMWSPAGEMAISSEEKVYNWLRQAALVKRQLRSS120Query115Q-DLDVKPDIVLPGNLSLLSEAYDRCGEVCAEYAKTFYLGTLLMTSERRRAIWAIYWCR173+LDVKPDIVLPGLSL++EAYDRCGEVCAEYAKTFYLGTLLMTERR+AIWAIYVWRSbjct121SGELDVKPDIVLPGTLSLMTEAYDRCGEVCAEYAKTFYLGTLLMTPERRKAIWAIYVWWR180Query174RTDELVDGPNASHITPTALDRWEARLEDLFRGRPFDMFDAALSDTVTKFPVDIQPFKDVI233RT+ELVDGPNASHITPTALDRWEARLEDLF+GRPFDMDAALSDTVKFPVDIQPFD+ISbjct181RTEELVDGPNASHITPTALDRWEARLEDLFQGRPFDM.DAALSDTVAKFPVDIQPFIDMI240Query234EGM^DLKKTRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPVMGIAPESQAPTESVYNAALALGIA293EGMR+DL+K+RYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVP+MGIAPESQATESVYNMLALGIASbjct241EGMRMDLK(SRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPIMGIAPESQATTESVYNAALALGIA300Query294NQLTNILRDVGEDARRGRIYLPQDELVQAGLSDDDIFAGKVTDKWRNFMKSQIKRARMFF353NQLTNILRDVGEDARRGRIYLPQDELQAGLSDDDIFAGVTDKffRNFMKQIKRARMFFSbjct301NQLTNILRDVGEDARRGRIYLPQDELAQAGLSDDDIFAGTVTDKWRNFMKKQIKRARMFF360Query354NEAEKGVTELSAASRWPWASLELYQKILDEIEANDYNNFTKRAYVSKAKKLASLPIAYA413+EAEKGVTELSAASRffPVffASLLY+KILDEIEANDYNNFTKRAYVSKAKK++LPI+YASbjct361DEAEKGVTELSAASRWPWASLLLYRKILDEIEANDYNNFTKRAYVSKAKKILALPISYA420Query414RSFVGPSRISTPLRK428RS+GPSRS+KSbjct421RSLIGPSRTSSSANK435Query麻疯树JcPSY蛋白的氨基酸序列Sbjct番木瓜CpPSY蛋白的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.ABG72805)图1是麻疯树PSY蛋白的疏水性分析图。其中，疏水性分析图是基于Kyte和Doolittle报道的氨基酸的疏水值而建立的。图2是麻疯树PSY蛋白的氨基酸跨膜分析图。图3是麻疯树PSY蛋白的氨基酸序列的结构域分析图。具体实施例方式下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1麻疯树PSY蛋白基因的克隆1.组织分离(isolation)麻疯树种子来源于四川省攀枝花地区，麻疯树种子采集后，放在实验室保存。2.RNA的分离(RNAisolation)将麻疯树种子的种皮剥掉，取出种仁，用研钵研碎，加入液氮后，研磨成粉后，取IOOmg移至1.5mLEP管中，抽提总RNA(两步裂解法)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。3.基因的全长克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根据一些植物PSY的氨基酸保守序列，设计兼并引物，利用同源性基因克隆原理，SMARTRACEcDNA扩增方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分四个阶段进行(1)核心序列的克隆PCR(JcPSYF+JcPSYR)得到PSY-I(422bp)，回收，连接到pMD_18T载体上，用M13F或M13R作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的模式植物番木瓜等的PSY基因的同源性很高，故初步认为它是一个PSY基因。(2)3，-RACE根据核心序列的扩增的结果，设计两个正向特异引物(JcPSYFl和JcPSYF2)。采用二次PCR扩增方法进行。第一次PCR(JcPSYFl+AP)得到PCR产物，稀释100倍后，用其做模板，进行第二次PCR(JcPSYF2+AP)，得到JcPSY_3(850bp)，回收，连接，测序过程同(1))。(3)5，-RACE根据核心序列的扩增的结果，设计两个反向特异引物(JcPSYRl和JcPSYR2)。采用二次PCR扩增方法进行。第一次PCR(JcPSYRl+UPM)得到PCR产物，稀释100倍后，用其做模板，进行第二次PCR(JcPSYR2+NUP)，得到JcPSY_5(678bp)，回收，连接，测序(过程同(1))。(4)编码序列的克隆将5’RACE测序结果与3’RACE测序结果比对并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行JcPSY编码区(JcPSYful1-F+JcPSYfull-R)PCR扩增，得到JcPSY编码区(1287bp)(过程同(D)0通过组合使用上述4种方法，获得了候选的麻疯树PSY蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物JcPSYfull-F:5-ATGACCGTCGCATTACTATGGGTTGCA-3(SEQIDNO.3)为正向引物，寡核苷酸JcPSYfulI-R5-TTATGCCTTCCTCAAAGGAGTTGAGATTC-3(SEQIDNO.4)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR条件为94°C5分钟，随之以94°C1分钟、58°C1分钟和72°C2分钟进行35个循环，最后以72°C延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1290bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示的序列。实施例2麻疯树PSY蛋白基因的序列信息与同源性分析本发明新的麻疯树PSY蛋白全长cDNA的长度为1755bp，详细序列见SEQIDN0.1，其中开放读框位于78-1364位核苷酸。根据全长cDNA推导出麻疯树PSY蛋白的氨基酸序列，共429个氨基酸残基，分子量48068.52，pi为8.96。详细序列见SEQIDNO.2。将麻疯树PSY蛋白的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现麻疯树PSY基因的核苷酸序列与其它植物的核苷酸序列如甜橙(C.sinensis)(DQ235260)，柑橘(C.unshiu)(AF220218)，柚子(C.maxima)(EU375852)，葡萄柚(C.paradisi)(AF152892)，四季桔(Citrofortunellamitis)(EU375851)，番木瓜(C.papaya)等有一定的同源性。但麻疯树PSY的氨基酸序列与其它植物的氨基酸序列有着更广泛和较高的相似性，如与麻疯树PSY的氨基酸序列与其它植物的氨基酸序列有着广泛的相似性，如与番木瓜(C.papaya)(ABG72805)，胡萝卜(D.carota)(ABB52068)，咖啡(Coffeacanephora)(ABA43898)，番茄(S.lycopersicum)(ABU40771)，柑橘(C.unshiu)(AF220218)，梅花(Prunusmume)(BAF49052)的一致性分别为81%,76%,77%,78%,78%^P77%，相似性分别为90%,88%,88%,87%,86%^P88%。实施例3麻疯树PSY蛋白的结构特征分析1.麻疯树PSY蛋白的结构域分析将麻疯树PSY蛋白的氨基酸序列在NCBI数据库(网址为http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中检索结构域，得到结果见图3。在氨基酸序列中，存在异戊烯基焦磷酸合成酶(Trans-IsoprenylDiphosphateSynthases,Trans_IPPS)的催化位点(即序列表中SEQID.1自氨基端(N端)第137-404位氨基酸残基。2.麻疯树PSY蛋白信号肽分析植物类胡萝卜素合成酶类是由细胞核基因编码的，编码翻译形成N端存在转运肽序列的前体(precursors)，转运肽具有将植物类胡萝卜素合成酶类转运至质体的功能，在转运过程或转运后则被剪切，植物类胡萝卜素合成酶类以成熟蛋白(matureproteins)形式进入质体。将JcPSY的氨基酸序列用ChloroP软件进行分析，发现全长JcPSY氨基酸序列中有由28个氨基酸构成的转移肽(即cTP)，其剪切位点位于第28和29个氨基酸之间，这在拟南芥、番茄和向日葵等植物中也有报道。3.麻疯树PSY蛋白的疏水性分析对转运肽剪切后的成熟PSY进行分析，发现其含有多个疏水性区域，尤其是第224-245位氨基酸疏水性很强，具有明显的跨膜趋势(图1)。4.麻疯树PSY蛋白的氨基酸跨膜分析通过TMHMM预测发现成熟PSY的第223-245位氨基酸为一跨膜螺旋结构，表明麻疯树成熟PSY是一个N端向内、C端向外的跨膜结合蛋白，第223-245位氨基酸是其与膜固定结合的位点(图2)。实施例4麻疯树八氢番茄红素合成酶cDNA的活性分析在该实施例中，将全长的麻疯树JcPSY编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以鉴定JcPSY的活性。麻疯树JcPSY原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌根据麻疯树JcPSY的氨基酸序列，设计蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pBluescriptIIKS-vector载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将麻疯树JcPSY基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pBluescriptIIKS-vector(Stratahene)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌DHlOB(该菌带有pACCAR25ΔcrtB质粒，质粒上带有来源于噬夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)合成类胡萝卜素的ctr基因簇，但缺失该种中的CtrB即PSY基因)，筛选鉴定得到含有JcPSY表达载体的工程菌DHlOB-JcPSY。结果观察在生长大肠杆菌的平板上，没有转入JcPSY基因的大肠杆菌DHlOB在平板上生长的颜色为白色，转入了JcPSY基因的大肠杆菌DHlOB在平板上生长的颜色为黄色，说明在转入了JcPSY基因的转化平板上有类胡萝卜素的生成，进一步说明JcPSY能代替噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)中的ctrB基因，促进类胡萝卜素的生成。使用来源于小鼠和拟南芥的PSY基因做对照，转入麻疯树JcPSY基因的菌的颜色比转入小鼠和拟南芥的psy基因的菌的颜色深，说明麻疯树JcPSY基因具有较高的活性。实施例5麻疯树八氢番茄红素合成酶cDNA的功能分析在该步骤中，将编码麻疯树八氢番茄红素合成酶的cDNA序列构建入植物表达载体之中，并转化烟草，以鉴定其功能。1.植物表达载体的构建依据麻疯树八氢番茄红素合成酶全长cDNA序列(表1)，设计扩增出完整阅读框的引物，分别在正反引物上引入限制性内切酶位点。以实施例1步骤3中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，保证麻疯树八氢番茄红素合成酶的阅读框完全正确。用内切酶酶切，载体P2300用也用相同的内切酶酶切，分别回收目的片段。将经酶切的麻疯树八氢番茄红素合成酶cDNA的目的片段与经相应内切酶切过的P2300载体连接，转化大肠杆菌DH5α，37°C培养20h，进行重组子的PCR鉴定和酶切鉴定。2.植物表达载体转化农杆菌(1)取一份感受态农杆菌EHA105，加入含麻疯树八氢番茄红素合成酶cDNA的植物表达载体约lpg，轻轻混勻；(2)于液氮中速冻2分钟，37°C温育5分钟；(3)加入500μLYEB液体培养基，28°C轻摇2-4小时，消除感受态；(4)分别取50-200μL菌液，分别涂布于含适当抗生素的YEB选择平板上，28°C倒置培养两天。(5)鉴定呈阳性的农杆菌EHA105单菌落，接种到含50mg/L利福平，100mg/L那霉素的20ml液体YEB培养基中，于28°C恒温摇床振荡培养30个小时至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释20-30倍。3.烟草的遗传转化及再生(1)取无菌烟草叶片，切除叶片边缘与中脉，于Ms+l.Omg/LNAA固体培养基中28°C预培养2天；(2)重新取出材料，放入无菌MS液体培养基稀释过的带有目的基因的农杆菌中，浸泡15分钟，然后在有28°C摇床中低速摇15分钟；(3)取出小叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于MS固体培养基中28°C暗培养两天；(4)把小叶片，用加100mg/LCb的无菌水洗两次，无菌滤纸吸去多余菌液后，转入含100mg/LKm和100mg/LCb分化培养基Ml中，28°C光下培养至分化出愈伤组织，直至长出芽，其间每15天继代一次；(5)将长至3-5cm的芽转入生根培养基1/2MS上诱导生根。(6)经鉴定为阳性转基因烟草后，继续培养成苗。4.转基因烟草叶片类胡萝卜素的提取(1)取各转基因烟草叶片，迅速冷冻干燥，制成冻干粉，置真空干燥箱中避光保存，并尽并尽快测定。(2)准确称取冻干粉l.OOOg于具塞三角瓶中，加入提取液(丙酮乙醇=32)45mL，摇勻，盖上瓶塞，用超声波提取20分钟，过滤于50mL容量瓶中并定容。取20mL滤液置分液漏斗中，加入IOmL石油醚混勻，加入IOmL蒸馏水进行分配，取石油醚相置旋转蒸发瓶中，剩余水加入IOmL石油醚进行再分配，合并2次石油醚相置旋转蒸发仪上，40-45°C蒸干，用2.OmL异丙醇溶解，过滤后上机测定。5.高效液相色谱法测定转基因烟草叶片类胡萝卜素(I)B-胡萝卜素标样的制备B-胡萝卜素标准品(Sigma公司产品)1.0mg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液转入25.Oml容量瓶中，用石油醚定容，浓度为0.04mg/ml，冰箱保存。临用时，吸取1.Oml于10.Oml容量瓶中，加流动相至刻度，此时浓度为0.004mg/ml。(2)番茄红素标样的制备番茄红素标准品(Sigma公司产品)1.Omg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液转入25.Oml容量瓶中，用石油醚定容，浓度为0.04mg/ml,冰箱保存。临用时，吸取1.Oml于10.Oml容量瓶中，加流动相至刻度，此时浓度为0.004mg/mlο(3)测定方法流动相乙睛三氯甲烷(928)。检测波长双波长测定，470nm(0-min)和450nm(8_13min)。流速1.OmL/min。柱温35°C。观测样品在470nm与450nm处有吸收峰的大小变化。本发明涉及的序列及记号分列如下<110>复旦大学<120>麻疯树八氢番茄红素合成酶基因序列及在植物中的应用<160>2<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1755<212>mRNA<213>(JatrophacarcasL.)<220><221>CDS<222>(78)..(1364)<223><400>1GGAAATTTGCATAGACAAGGTAAACAAAGAAAGAAAGAAAAAAATAAAAAAATAAAAATAAAAATCTGGTTTTGAACATGACCGTCGCATTACTATGGGTTGCAACACCAAGTMetThrValAlaLeuLeuTrpValAlaThrProSer1510ACAGAGGCTTCCAATTCATTTGGGTTTCTCCATTCGGTTCGGGTCTTAGATThrGluAlaSerAsnSerPheGlyPheLeuHisSerValArgValLeuAsp152025TCGTCGAAAGTTGGTTCTCTAGATCGGAATTTGACGTTTAAGGGAAGAGCASerSerLysValGlySerLeuAspArgAsnLeuThrPheLysGlyArgAla30354045AAAAAGGGTAGGAGTCAAAAATGGAAGTCAAGCTCAGTTAATATAGATTTGLysLysGlyArgSerGlnLysTrpLysSerSerSerValAsnlieAspLeu505560AGGAATCCTTGTATAGGTAGTGGAAGCGAATTCCCTGTATTAGCAAGTATGArgAsnProCyslieGlySerGlySerGluPheProValLeuAlaSerMet65707580ATTGCCAGTCCAGCTGGAGAAATGGCTATCTCGTCAGAGGAGAAGGTATAClieAlaSerProAlaGlyGluMetAlalieSerSerGluGluLysValTyr859095AATGTGGTGATGAAGCAGGCAGCTTTGGTTAAAAAGCAATTAAGGTCTAATAsnValValMetLysGlnAlaAlaLeuValLysLysGlnLeuArgSerAsn100105110CAAGATCTTGATGTGAAACCAGATATTGTTCTTCCAGGAAATCTGAGTTTGGlnAspLeuAspValLysProAsplieValLeuProGlyAsnLeuSerLeu115120125130TTGAGTGAAGCTTACGATAGATGTGGAGAAGTTTGTGCTGAGTATGCAAAALeuSerGluAlaTyrAspArgCysGlyGluValCysAlaGluTyrAlaLys135140145ACATTTTACTTGGGAACTTTGCTGATGACTTCTGAAAGAAGAAGAGCTATCThrPheTyrLeuGlyThrLeuLeuMetThrSerGluArgArgArgAlalie150155160TGGGCAATATATGTGTGGTGTCGCAGGACTGATGAGCTTGTTGATGGGCCTTrpAlalieTyrValTrpCysArgArgThrAspGluLeuValAspGlyPro165170175180AATGCTTCACACATAACGCCAACAGCTTTAGATAGGTGGGAGGCAAGGTTGAsnAlaSerHislieThrProThrAlaLeuAspArgTrpGluAlaArgLeu185190195GAAGACCTTTTCCGAGGTCGTCCATTTGATATGTTTGATGCTGCTTTATCAGluAspLeuPheArgGlyArgProPheAspMetPheAspAlaAlaLeuSer200205210215GACACGGTTACTAAATTTCCTGTTGACATTCAGCCATTCAAAGATGTGATTAspThrValThrLysPheProValAsplieGlnProPheLysAspVallie220225230GAAGGAATGAGGCTGGACCTGAAGAAAACAAGATATAAGAACTTTGATGAGGluGlyMetArgLeuAspLeuLysLysThrArgTyrLysAsnPheAspGlu235240245250CTTTATCTTTACTGTTATTATGTTGCTGGGACGGTTGGATTGATGAGTGTTLeuTyrLeuTyrCysTyrTyrValAlaGlyThrValGlyLeuMetSerVal255260265CCGGTCATGGGCATTGCACCTGAATCACAGGCACCAACTGAGAGCGTCTATProValMetGlylieAlaProGluSerGlnAlaProThrGluSerValTyr270275280AATGCTGCCTTGGCATTAGGAATAGCAAATCAGCTTACCAACATACTCAGGAsnAlaAlaLeuAlaLeuGlylieAlaAsnGlnLeuThrAsnlieLeuArg285290295300GATGTGGGAGAGGATGCAAGAAGAGGAAGGATTTATTTACCACAAGATGAGAspValGlyGluAspAlaArgArgGlyArglieTyrLeuProGlnAspGlu305310315CTCGTGCAGGCTGGACTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGGAAAGTGACALeuValGlnAlaGlyLeuSerAspAspAspliePheAlaGlyLysValThr320325330335GATAAATGGAGAAATTTTATGAAGAGTCAAATTAAGAGGGCAAGGATGTTCAspLysTrpArgAsnPheMetLysSerGlnlieLysArgAlaArgMetPhe340345350TTCAATGAGGCAGAGAAAGGAGTGACCGAGTTGAGTGCCGCAAGTAGATGGPheAsnGluAlaGluLysGlyValThrGluLeuSerAlaAlaSerArgTrp355360365CCGGTATGGGCATCTTTAGAATTATATCAGAAAATTCTAGATGAGATAGAAProValTrpAlaSerLeuGluLeuTyrGlnLyslieLeuAspGlulieGlu370375380385GCCAATGATTACAATAACTTCACAAAGAGAGCATATGTAAGCAAAGCCAAGAlaAsnAspTyrAsnAsnPheThrLysArgAlaTyrValSerLysAlaLys390395400AAGTTAGCTTCTTTACCAATTGCATATGCAAGATCATTTGTTGGGCCATCALysLeuAlaSerLeuProlieAlaTyrAlaArgSerPheValGlyProSer405410415420AGAATCTCAACTCCTTTGAGGAAGGCATAAATGTCAAATCATGAACATCATATATAGArglieSerThrProLeuArgLysAla425AAGAAAAGGGAAAAATACCATAATTAATTTGTATATTAGCAACTTTTGTAATGCAGCAAGTGGAAGCAAGAACAGTCAATTCAAATTTTATTTGAAGGGATGAACTGTATATATTCTGCTAGGAACTTAAAGCTTCTTGGTTTAGAGAGTGTTTAGTGTTTTAAGAGAAGACTCATCTAAGAGTCTGCTTGTGCTTTTCTACCCTCACGTAGACATGGCTGGTTAACCAAACCGGTGGTTCATGGCCTTTAAAAGTAGGAACTGAGAACGGTCTTAATCAGGCTGGTTTAATTCAATTTCGATTCAATCGGGCTGGTTTAATTCAATTTCGATTCTGTAAAATGAAAAAAAAAAAAAAAAA<210>2<211>429<212>PRT<213>(JatrophacarcasL.)<400>2MetThrValAlaLeuLeuTrpValAlaThrProSerThrGluAlaSer151015AsnSerPheGlyPheLeuHisSerValArgValLeuAspSerSerLys202530ValGlySerLeuAspArgAsnLeuThrPheLysGlyArgAlaLysLys354045GlyArgSerGlnLysTrpLysSerSerSerValAsnlieAspLeuArg505560AsnProCyslieGlySerGlySerGluPheProValLeuAlaSerMet65707580lieAlaSerProAlaGlyGluMetAlalieSerSerGluGluLysVal859095TyrAsnValValMetLysGlnAlaAlaLeuValLysLysGlnLeuArg100105110SerAsnGlnAspLeuAspValLysProAsplieValLeuProGlyAsn115120125LeuSerLeuLeuSerGluAlaTyrAspArgCysGlyGluValCysAla130135140GluTyrAlaLysThrPheTyrLeuGlyThrLeuLeuMetThrSerGlu145150155160ArgArgArgAlalieTrpAlalieTyrValTrpCysArgArgThrAsp165170175GluLeuValAspGlyProAsnAlaSerHislieThrProThrAlaLeu180185190AspArgTrpGluAlaArgLeuGluAspLeuPheArgGlyArgProPhe195200205AspMetPheAspAlaAlaLeuSerAspThrValThrLysPheProVal210215220AsplieGlnProPheLysAspVallieGluGlyMetArgLeuAspLeu225230235240LysLysThrArgTyrLysAsnPheAspGluLeuTyrLeuTyrCysTyr245250255TyrValAlaGlyThrValGlyLeuMetSerValProValMetGlylie260265270AlaProGluSerGlnAlaProThrGluSerValTyrAsnAlaAlaLeu275280285AlaLeuGlylieAlaAsnGlnLeuThrAsnlieLeuArgAspValGly290295300GluAspAlaArgArgGlyArglieTyrLeuProGlnAspGluLeuVal305310315320GlnAlaGlyLeuSerAspAspAspliePheAlaGlyLysValThrAsp325330335LysTrpArgAsnPheMetLysSerGlnlieLysArgAlaArgMetPhe340345350PheAsnGluAlaGluLysGlyValThrGluLeuSerAlaAlaSerArg355360365TrpProValTrpAlaSerLeuGluLeuTyrGlnLyslieLeuAspGlu370375380lieGluAlaAsnAspTyrAsnAsnPheThrLysArgAlaTyrValSer385390395400LysAlaLysLysLeuAlaSerLeuProlieAlaTyrAlaArgSerPhe405410415ValGlyProSerArglieSerThrProLeuArgLysAla420425<210>3<211>27<212>DNA<213>(JartrophacurcasL.)<400>3ATGACCGTCGCATTACTATGGGTTGCA<210>4<211>29<212>DNA<213>(JatrophacurcasL.)<400>4TTATGCCTTCCTCAAAGGAGTTGAGATTC权利要求一种分离出DNA分子，其特征在于，它包括编码具有麻疯树JcPSY蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1中从核苷酸第78-1364位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQIDNO.1中从核苷酸第78-1364位的核苷酸序列杂交。2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQIDNO.1中从核苷酸第78-1364位的核苷酸序列。4.一种分离的麻疯树JcPSY蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDN0.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQIDN0.2序列的多肽。6.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，用于构建所述植物表达载体的出发载体，所述出发载体选自p3301-BI121、pB1121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或PCAMBIA1300。8.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞，其特征在于它是原核或真核细胞。9.一种产生具有麻疯树JcPSY蛋白质活性的多肽的方法，特征在于其步骤如下(1)将编码具有麻疯树JcPSY蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成麻疯树JcPSY蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1中从核苷酸第78-1364位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成麻疯树JcPSY蛋白的重组细胞；(3)在适合表达麻疯树JcPSY蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有麻疯树JcPSY蛋白活性的基本纯的多肽。10.一种利用转基因技术将编码具有麻疯树JcPSY蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物中β“胡萝卜素的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将编码具有麻疯树JcPSY蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含麻疯树JcPSY蛋白的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1中从核苷酸第78-1364位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入植物宿主细胞。其特征在于所述植物宿主为水稻、小麦、大豆、玉米、烟草、油菜、高粱、棉花、苜蓿、麻疯树或拟南芥。(3)通过筛选如抗生素筛选，获得转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。转基因植物及其后代对植物干旱耐受性具有增强的作用。11.一种与权利要求4所述的麻疯树JcPSY蛋白多肽多肤特异性结合的抗体，其特征在于它包括多克隆抗体和单克隆抗体。12.一种核酸分子探针，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。13.一种用于检测样品中是否存在麻疯树JcPSY核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用权利要求12所述探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。14.权利要求13所述的检测方法，其特征在于所述样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于麻疯树JcPSY核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度为15-50个核苷酸。全文摘要本发明涉及分子生物学、基因工程
技术领域：
。涉及一种在麻疯树中表达麻疯树八氢番茄红素合成酶JcPSY蛋白及其核酸序列。利用本发明的麻疯树PSY蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与麻疯树PSY蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。本发明的麻疯树PSY蛋白基因可通过基因工程技术用来提高植物中的β-胡萝卜素含量，用以提高植物的经济价值，具有明显的市场应用前景。文档编号C12N9/00GK101798577SQ20091025338公开日2010年8月11日申请日期2009年12月3日优先权日2009年3月6日发明者侯嵘,周选围,林娟申请人:复旦大学