专利名称：黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因的制作方法
技术领域：
发明涉及一种基因工程技术领域；具体涉及一种用于克隆黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因。
背景技术：
所有的黄瓜类胡萝卜素均通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成。其代谢主链上有5种酶参与，分别是八氢番茄红素合成酶八氢番茄红素合成酶基因PSY、八氢番茄红素脱饱和酶ros、ξ -胡萝卜素脱饱和酶ZDS、番茄红素β -环化酶LycB和番茄红素ε -环化酶LycE。随着分子生物学研究手段的发展，编码这些酶的基因已从番茄、烟草、辣椒、拟南芥、玉米等植物中陆续分离鉴定。目前有关黄瓜类胡萝卜素合成酶基因全长的克隆国内外 还未见报道。
发明内容
发明的目的是提供一种利用已知其他植物的八氢番茄红素合成酶基因PSY设计序列作为引物，采用聚合酶链反应PCR技术从黄瓜品种中得到基因，并构建得到其重组质粒pT-PSY。上述的目的通过以下的技术方案实现
一种黄瓜类胡萝卜素八氢番爺红素合成酶基因，其核苷酸序列SEQ ID的长度为1479bp，具有以下的核苷酸序列
AGTGGGAGTTTCATCCGTGTCGAAGCATTGCTTAGAATTTCTTGGGCGGTTTAGTTGGATTTAAGTTATCTT
TGCTTTTCCATTTCATTTTGCTACTGGGTTTCTCGATTCCTCCTGCGATTCGTTCATTGAAAGCCTTGGAATTCTTC
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GACGAACTTTATCTCTACTGTTATTATGTTGCTGGTACAGTTGGGTTGATGAGTGTCCCTGTCATGGGCATTGCACC
TGAGTCCGAAGCAAGCACAGAGAGTGTGTACAATGCTGCCTTAGCATTAGGCATTGCTAATCAAGCTCCACCAAACA
TTCTCAGAGATGTTGGAGAAGATGCTAGAAGAGGAAGAATATATCTACCACAAGATGAGCTAGCACAGGCAGGACTT
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TATTATATAGGCAAATATTGGATGGGATTGAAGCAAATGACTACAACAACTTCACAAAGAGGGCTTATGTGAGGAAA
GGCAAGAAAATATTGGCTTTGCCAATGGCTTATGCAAGGGCCCTCCTTGGCCCTTCATGAATTTACACCTCTATACACTCAACAAACACAATCAAAAT。一种由权利要求I所述的基因编码的多肽，它包含422个氨基酸，分子量为47393. 507Da，等电点为6. 545。在pH7. O时，电荷为O. 777。具有以下的氨基酸序列MSLASSLVVSPNVELSPSNFGFLDSLRDGPQIPDSFRFFSRNRVPNLINKRQKWGNPSHSTELKYPILCESGYGSVIAASMVANPAGEMAVSAEQKVYNVAMKQAALVKRQLRTAGELDVKPDIVLPGTLSLLNEAYDRCGEVCAEYAKTFYLGTMLMTPERQKAIWAIYVWCRRTDELVDGPNASHITPTALDRWEARLEELFQGRPFDMLDAALADTVTKFPVDIQPFKDTIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPVMGIAPESEASTESVYNAALALGIANQAPPNILRDVGEDARRGRIYLPQDELAQAGLSDEDIFAGRVTDKWRNFMKSQIKRARMFFDEAEKGVLELNKASRWPVWASLLLYRQILDGIEANDYNNFTKRAYVRKGKKILALPMAYARALLGPS *。一种包含权利要求I所述基因的重组质粒pT-PSY，它的长度为4515bp，包含氨苄青霉素筛选标记；具有以下的核苷酸序列
GGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTGGATCGCCCTT AGTGGGAGTTTCATCCGTGTCGAAGCATTGCTTAGAATTTCTTGGGCGGTTTAGTTGGATTTAAGTTATCTTTGCTT
TTCCATTTCATTTTGCTACTGGGTTTCTCGATTCCTCCTGCGATTCGTTCATTGAAAGCCTTGGAATTCTTCTAGTG
GGATTAAAATCGATTGATATGTCTTTAGCTTCATCGTTAGTTGTTTCTCCCAACGTTGAACTTTCCCCATCCAACTT
TGGGTTTCTTGATTCTCTTCGAGATGGACCCCAAATTCCCGATTCTTTTAGATTCTTTTCGCGAAATCGAGTGCCAA
ATCTGATTAACAAGAGACAGAAGTGGGGGAATCCCTCTCATTCTACAGAACTGAAATACCCAATTCTCTGTGAAAGT
GGATATGGGTCTGTTATTGCAGCAAGTATGGTGGCGAATCCCGCCGGAGAAATGGCCGTCTCAGCTGAGCAGAAGGT
GTATAACGTAGCTATGAAACAGGCGGCTCTGGTGAAACGACAACTTAGAACCGCCGGAGAATTGGATGTGAAGCCGG
ATATTGTTCTTCCGGGGACTTTGAGCTTGTTGAATGAGGCTTATGATCGTTGTGGTGAAGTTTGTGCAGAGTATGCC
AAGACATTTTATCTGGGAACTATGTTGATGACACCGGAGAGGCAAAAGGCTATTTGGGCAATTTATGTATGGTGTAG
GCGGACAGATGAACTTGTTGATGGGCCAAATGCTTCACACATAACACCTACTGCATTGGACAGATGGGAGGCAAGGT
TGGAAGAGCTTTTCCAAGGGAGGCCATTCGATATGCTCGATGCAGCTTTGGCGGATACCGTTACTAAGTTCCCTGTC
GATATTCAGCCATTCAAAGATACGATCGAAGGGATGCGGATGGATCTAAGGAAGTCGAGATACAAGAATTTCGACGA
ACTTTATCTCTACTGTTATTATGTTGCTGGTACAGTTGGGTTGATGAGTGTCCCTGTCATGGGCATTGCACCTGAGT
CCGAAGCAAGCACAGAGAGTGTGTACAATGCTGCCTTAGCATTAGGCATTGCTAATCAAGCTCCACCAAACATTCTC
AGAGATGTTGGAGAAGATGCTAGAAGAGGAAGAATATATCTACCACAAGATGAGCTAGCACAGGCAGGACTTTCAGA
TGAGGACATATTTGCTGGAAGAGTAACTGATAAATGGAGAAACTTCATGAAGAGTCAGATTAAGAGAGCTAGAATGT
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TATAGGCAAATATTGGATGGGATTGAAGCAAATGACTACAACAACTTCACAAAGAGGGCTTATGTGAGGAAAGGCAA
GAAAATATTGGCTTTGCCAATGGCTTATGCAAGGGCCCTCCTTGGCCCTTCATGAATTTACACCTCTATACACTCAA
CAAACACAATCAAAATAGGGCGATCCATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCC
CAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTT
CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGC
CTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGC
TGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGAC
TCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATC
AGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGG
CGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGG
ATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGT
AGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTAT
CGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAG
GTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTA GAAGAACAGTATTTGGTATCT
GCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGC
GGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTAC
GGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCT
AGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAA
TGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTA
GATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTC
CAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATC
CAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGC
TACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTA
CATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCA
GTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGAC
TGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGG
ATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGG
ATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCAC
CAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAA
TACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAA
TGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGATGCGGTGTGAAATAC
CGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATT
TTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAG
ATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAA
AACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAG
CACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAA
GGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGC
CGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCG
GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTT
CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAo有益效果
I.本发明获得黄瓜类胡萝卜素合成酶基因八氢番茄红素合成酶基因PSY，可通过基因工程手段调控植物体内类胡萝卜素的代谢和积累，为创造类胡萝卜素含量更高的品系，改良果蔬的营养品质，实现工厂化生产天然类胡萝卜素提供条件。2.发明的黄瓜类胡萝卜素既是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标，也是影响果实外观品质和花卉观赏价值的重要因素，了解植物类胡萝卜素积累的特点与代谢的生理机制，对于进一步调控植物类胡萝卜素的生物合成途径，改善园艺植物的食用品质和观赏品质具有重要的意义。
3.本发明首次成功的获得黄瓜PSY基因(八氢番茄红素合成酶基因)的完整序列，将有助于进一步研究黄瓜类胡萝卜素合成代谢途径和其内部类胡萝卜素的组成，为进一步开展黄瓜类胡萝卜素代谢基因工程，改善和提高黄瓜类胡萝卜素的含量和组分奠定基础。4.发明为黄瓜育种提供基因源，为创造类胡萝卜素含量更高的黄瓜品系，改良黄瓜的营养品质提供条件，具有广阔的经济价值和社会价值。
附图I是本发明的黄瓜类胡萝卜素合成酶基因八氢番茄红素合成酶基因PSY的序列表。附图2是本发明的黄瓜类胡萝卜素合成酶基因八氢番茄红素合成酶基因PSY编码的多肽的序列表。 附图3是本发明的基因的重组质粒pT-PSY的序列表。
具体实施例方式 实施例I :
一种黄瓜类胡萝卜素八氢番爺红素合成酶基因，其核苷酸序列SEQ ID的长度为1479bp，具有以下的核苷酸序列
AGTGGGAGTTTCATCCGTGTCGAAGCATTGCTTAGAATTTCTTGGGCGGTTTAGTTGGATTTAAGTTATCTTTGCTTTTCCATTTCATTTTGCTACTGGGTTTCTCGATTCCTCCTGCGATTCGTTCATTGAAAGCCTTGGAATTCTTCTAGTGGGATTAAAATCGATTGATATGTCTTTAGCTTCATCGTTAGTTGTTTCTCCCAACGTTGAACTTTCCCCATCCAACTTTGGGTTTCTTGATTCTCTTCGAGATGGACCCCAAATTCCCGATTCTTTTAGATTCTTTTCGCGAAATCGAGTGCCAAATCTGATTAACAAGAGACAGAAGTGGGGGAATCCCTCTCATTCTACAGAACTGAAATACCCAATTCTCTGTGAAAGTGGATATGGGTCTGTTATTGCAGCAAGTATGGTGGCGAATCCCGCCGGAGAAATGGCCGTCTCAGCTGAGCAGAAGGTGTATAACGTAGCTATGAAACAGGCGGCTCTGGTGAAACGACAACTTAGAACCGCCGGAGAATTGGATGTGAAGCCGGATATTGTTCTTCCGGGGACTTTGAGCTTGTTGAATGAGGCTTATGATCGTTGTGGTGAAGTTTGTGCAGAGTATGCCAAGACATTTTATCTGGGAACTATGTTGATGACACCGGAGAGGCAAAAGGCTATTTGGGCAATTTATGTATGGTGTAGGCGGACAGATGAACTTGTTGATGGGCCAAATGCTTCACACATAACACCTACTGCATTGGACAGATGGGAGGCAAGGTTGGAAGAGCTTTTCCAAGGGAGGCCATTCGATATGCTCGATGCAGCTTTGGCGGATACCGTTACTAAGTTCCCTGTCGATATTCAGCCATTCAAAGATACGATCGAAGGGATGCGGATGGATCTAAGGAAGTCGAGATACAAGAATTTCGACGAACTTTATCTCTACTGTTATTATGTTGCTGGTACAGTTGGGTTGATGAGTGTCCCTGTCATGGGCATTGCACCTGAGTCCGAAGCAAGCACAGAGAGTGTGTACAATGCTGCCTTAGCATTAGGCATTGCTAATCAAGCTCCACCAAACATTCTCAGAGATGTTGGAGAAGATGCTAGAAGAGGAAGAATATATCTACCACAAGATGAGCTAGCACAGGCAGGACTTTCAGATGAGGACATATTTGCTGGAAGAGTAACTGATAAATGGAGAAACTTCATGAAGAGTCAGATTAAGAGAGCTAGAATGTTCTTCGATGAGGCCGAGAAAGGAGTTTTGGAGCTTAATAAAGCTAGCAGATGGCCGGTGTGGGCTTCTTTGCTATTATATAGGCAAATATTGGATGGGATTGAAGCAAATGACTACAACAACTTCACAAAGAGGGCTTATGTGAGGAAAGGCAAGAAAATATTGGCTTTGCCAATGGCTTATGCAAGGGCCCTCCTTGGCCCTTCATGAATTTACACCTCTATACACTCAACAAACACAATCAAAAT。实施例2:
一种由权利要求I所述的基因编码的多肽，它包含422个氨基酸，分子量为47393. 507Da，等电点为6. 545。在pH7. 0时，电荷为0. 777。具有以下的氨基酸序列MSLASSLVVSPNVELSPSNFGFLDSLRDGPQIPDSFRFFSRNRVPNLINKRQKWGNPSHSTELKYPILCESGYGSVIAASMVANPAGEMAVSAEQKVYNVAMKQAALVKRQLRTAGELDVKPDIVLPGTLSLLNEAYDRCGEVCAEYAKTFYLGTMLMTPERQKAIffAIYVWCRRTDELVDGPNASHITPTALDRWEARLEELFQGRPFDMLDAALADTVTKFPVDIQPFKDTIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPVMGIAPESEASTESVYNAALALGIANQAPPNILRDVGEDARRGRIYLPQDELAQAGLSDEDIFAGRVTDKWRNFMKSQIKRARMFFDEAEKGVLELNKASRWPVWASLLLYRQILDGIEANDYNNFTKRAYVRKGKKILALPMAYARALLGPS 女。实施例3:
一种包含权利要求I所述基因的重组质粒PT-PSY，它的长度为4515bp，包含氨苄青霉素筛选标记；具有以下的核苷酸序列
GGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTGGATCGCCCTT AGTGGGAGTTTCATCCGTGTCGAAGCATTGCTTAGAATTTCTTGGGCGGTTTAGTTGGATTTAAGTTATCTTTGCTT
TTCCATTTCATTTTGCTACTGGGTTTCTCGATTCCTCCTGCGATTCGTTCATTGAAAGCCTTGGAATTCTTCTAGTG
GGATTAAAATCGATTGATATGTCTTTAGCTTCATCGTTAGTTGTTTCTCCCAACGTTGAACTTTCCCCATCCAACTT
TGGGTTTCTTGATTCTCTTCGAGATGGACCCCAAATTCCCGATTCTTTTAGATTCTTTTCGCGAAATCGAGTGCCAA
ATCTGATTAACAAGAGACAGAAGTGGGGGAATCCCTCTCATTCTACAGAACTGAAATACCCAATTCTCTGTGAAAGT
GGATATGGGTCTGTTATTGCAGCAAGTATGGTGGCGAATCCCGCCGGAGAAATGGCCGTCTCAGCTGAGCAGAAGGT
GTATAACGTAGCTATGAAACAGGCGGCTCTGGTGAAACGACAACTTAGAACCGCCGGAGAATTGGATGTGAAGCCGG
ATATTGTTCTTCCGGGGACTTTGAGCTTGTTGAATGAGGCTTATGATCGTTGTGGTGAAGTTTGTGCAGAGTATGCC
AAGACATTTTATCTGGGAACTATGTTGATGACACCGGAGAGGCAAAAGGCTATTTGGGCAATTTATGTATGGTGTAG
GCGGACAGATGAACTTGTTGATGGGCCAAATGCTTCACACATAACACCTACTGCATTGGACAGATGGGAGGCAAGGT
TGGAAGAGCTTTTCCAAGGGAGGCCATTCGATATGCTCGATGCAGCTTTGGCGGATACCGTTACTAAGTTCCCTGTC
GATATTCAGCCATTCAAAGATACGATCGAAGGGATGCGGATGGATCTAAGGAAGTCGAGATACAAGAATTTCGACGA
ACTTTATCTCTACTGTTATTATGTTGCTGGTACAGTTGGGTTGATGAGTGTCCCTGTCATGGGCATTGCACCTGAGT
CCGAAGCAAGCACAGAGAGTGTGTACAATGCTGCCTTAGCATTAGGCATTGCTAATCAAGCTCCACCAAACATTCTC
AGAGATGTTGGAGAAGATGCTAGAAGAGGAAGAATATATCTACCACAAGATGAGCTAGCACAGGCAGGACTTTCAGA
TGAGGACATATTTGCTGGAAGAGTAACTGATAAATGGAGAAACTTCATGAAGAGTCAGATTAAGAGAGCTAGAATGT
TCTTCGATGAGGCCGAGAAAGGAGTTTTGGAGCTTAATAAAGCTAGCAGATGGCCGGTGTGGGCTTCTTTGCTATTA
TATAGGCAAATATTGGATGGGATTGAAGCAAATGACTACAACAACTTCACAAAGAGGGCTTATGTGAGGAAAGGCAA
GAAAATATTGGCTTTGCCAATGGCTTATGCAAGGGCCCTCCTTGGCCCTTCATGAATTTACACCTCTATACACTCAA
CAAACACAATCAAAATAGGGCGATCCATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCC
CAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTT
CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGC
CTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGC
TGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGAC
TCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATC
AGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGG
CGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACA
GGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGG
ATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTAT
CGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAG
GTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCT
GCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGC
GGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTAC
GGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCT
AGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAA
TGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTA
GATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTC
CAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATC
CAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGC
TACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTA
CATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCA
GTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGAC
TGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGG
ATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGG
ATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCAC
CAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAA
TACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAA
TGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGATGCGGTGTGAAATAC
CGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATT
TTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAG
ATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAA
AACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAG
CACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAA
GGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGC
CGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCG
GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTT
CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAo实施例4:
以上实施例所述的黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因，本基因是通过首先利用已知其他植物的八氢番茄红素合成酶基因PSY设计序列作为引物，采用聚合酶链反应PCR技术从黄瓜品种东农803的cDNA中分离得到黄瓜类胡萝卜素合成酶基因八氢番茄红素合成酶基因PSY，将其克隆到T载体，得到基因的重组质粒pT-PSY。并采用生物信息软件对所获得八氢番茄红素合成酶基因PSY的cDNA推导的氨基酸序列进行分析。实施例5:
以上实施例所述的黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因，所述的聚合酶链反应PCR技术是由于聚合酶链反应PCR产物两侧3端通常含单个脱氧腺苷酸A，与T载体之间的A-T互补性可提高聚合酶链反应PCR产物克隆的效率。
实施例6:
以上实施例所述的黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因，所述的T载体为聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧3端各多出一个脱氧胸苷酸T。实施例I
以上实施例所述的黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因，所述的生物信息软件antheproto实施例8:
以上实施例所述的黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因，所述的cDNA的提取方法是与核糖核酸链互补的单链脱氧核糖核酸，以其核糖核酸为模板，在适当引物的存在下，由核糖核酸与脱氧核糖核酸进行一定条件下合成得到cDNA。
实施例9
以上实施例所述的黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因，基因的重组质粒pT-PSY，是以序列表SEQ ID附图3、SEQ ID附图4为引物聚合酶链反应PCR扩增出的cDNA序列，回收得到1479bpDNA，将其克隆到pEASY-T3载体上，构建了重组质粒pT_PSY。本发明参照其它植物的八氢番茄红素合成酶基因PSY基因序列设计引物，采用聚合酶链反应PCR技术从黄瓜品种东农803的cDNA中分离到八氢番茄红素合成酶基因PSY基因，将其克隆到T载体，并采用生物信息软件对所获得八氢番茄红素合成酶基因PSY的cDNA推导的氨基酸序列进行分析。
权利要求
1.一种黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因，其特征是其核苷酸序列SEQ ID的长度为1479bp，具有以下的核苷酸序列AGTGGGAGTTTCATCCGTGTCGAAGCATTGCTTAGAATTTCTTGGGCGGTTTAGTTGGATTTAAGTTATCTTTGCTTTTCCATTTCATTTTGCTACTGGGTTTCTCGATTCCTCCTGCGATTCGTTCATTGAAAGCCTTGGAATTCTTCTAGTGGGATTAAAATCGATTGATATGTCTTTAGCTTCATCGTTAGTTGTTTCTCCCAACGTTGAACTTTCCCCATCCAACTTTGGGTTTCTTGATTCTCTTCGAGATGGACCCCAAATTCCCGATTCTTTTAGATTCTTTTCGCGAAATCGAGTGCCAAATCTGATTAACAAGAGACAGAAGTGGGGGAATCCCTCTCATTCTACAGAACTGAAATACCCAATTCTCTGTGAAAGTGGATATGGGTCTGTTATTGCAGCAAGTATGGTGGCGAATCCCGCCGGAGAAATGGCCGTCTCAGCTGAGCAGAAGGTGTATAACGTAGCTATGAAACAGGCGGCTCTGGTGAAACGACAACTTAGAACCGCCGGAGAATTGGATGTGAAGCCGGATATTGTTCTTCCGGGGACTTTGAGCTTGTTGAATGAGGCTTATGATCGTTGTGGTGAAGTTTGTGCAGAGTATGCCAAGACATTTTATCTGGGAACTATGTTGATGACACCGGAGAGGCAAAAGGCTATTTGGGCAATTTATGTATGGTGTAGGCGGACAGATGAACTTGTTGATGGGCCAAATGCTTCACACATAACACCTACTGCATTGGACAGATGGGAGGCAAGGTTGGAAGAGCTTTTCCAAGGGAGGCCATTCGATATGCTCGATGCAGCTTTGGCGGATACCGTTACTAAGTTCCCTGTCGATATTCAGCCATTCAAAGATACGATCGAAGGGATGCGGATGGATCTAAGGAAGTCGAGATACAAGAATTTCGACGAACTTTATCTCTACTGTTATTATGTTGCTGGTACAGTTGGGTTGATGAGTGTCCCTGTCATGGGCATTGCACCTGAGTCCGAAGCAAGCACAGAGAGTGTGTACAATGCTGCCTTAGCATTAGGCATTGCTAATCAAGCTCCACCAAACATTCTCAGAGATGTTGGAGAAGATGCTAGAAGAGGAAGAATATATCTACCACAAGATGAGCTAGCACAGGCAGGACTTTCAGATGAGGACATATTTGCTGGAAGAGTAACTGATAAATGGAGAAACTTCATGAAGAGTCAGATTAAGAGAGCTAGAATGTTCTTCGATGAGGCCGAGAAAGGAGTTTTGGAGCTTAATAAAGCTAGCAGATGGCCGGTGTGGGCTTCTTTGCTATTATATAGGCAAATATTGGATGGGATTGAAGCAAATGACTACAACAACTTCACAAAGAGGGCTTATGTGAGGAAAGGCAAGAAAATATTGGCTTTGCCAATGGCTTATGCAAGGGCCCTCCTTGGCCCTTCATGAATTTACACCTCTATACACTCAACAAACACAATCAAAAT。
2.一种由权利要求I所述的基因编码的多肽，它包含422个氨基酸，分子量为47393. 507Da，等电点为6. 545，在pH7. O时，电荷为0. 777，具有以下的氨基酸序列=MSLASSLVVSPNVELSPSNFGFLDSLRDGPQIPDSFRFFSRNRVPNLINKRQKWGNPSHSTELKYPILCESGYGSVIAASMVANPAGEMAVSAEQKVYNVAMKQAALVKRQLRTAGELDVKPDIVLPGTLSLLNEAYDRCGEVCAEYAKTFYLGTMLMTPERQKAIWAIYVWCRRTDELVDGPNASHITPTALDRWEARLEELFQGRPFDMLDAALADTVTKFPVDIQPFKDTIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPVMGIAPESEASTESVYNAALALGIANQAPPNILRDVGEDARRGRIYLPQDELAQAGLSDEDIFAGRVTDKWRNFMKSQIKRARMFFDEAEKGVLELNKASRWPVWASLLLYRQILDGIEANDYN NFTKRAYVRKGKKILALPMAYARALLGPS*。
3.一种包含权利要求I所述基因的重组质粒PT-PSY，它的长度为4515bp，包含氨苄青霉素筛选标记；具有以下的核苷酸序列GGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTGGATCGCCCTTAGTGGGAGTTTCATCCGTGTCGAAGCATTGCTTAGAATTTCTTGGGCGGTTTAGTTGGATTTAAGTTATCTTTGCTTTTCCATTTCATTTTGCTACTGGGTTTCTCGATTCCTCCTGCGATTCGTTCATTGAAAGCCTTGGAATTCTTCTAGTGGGATTAAAATCGATTGATATGTCTTTAGCTTCATCGTTAGTTGTTTCTCCCAACGTTGAACTTTCCCCATCCAACTTTGGGTTTCTTGATTCTCTTCGAGATGGACCCCAAATTCCCGATTCTTTTAGATTCTTTTCGCGAAATCGAGTGCCAAATCTGATTAACAAGAGACAGAAGTGGGGGAATCCCTCTCATTCTACAGAACTGAAATACCCAATTCTCTGTGAAAGTGGATATGGGTCTGTTATTGCAGCAAGTATGGTGGCGAATCCCGCCGGAGAAATGGCCGTCTCAGCTGAGCAGAAGGT
全文摘要
黄瓜类胡萝卜素合成酶基因八氢番茄红素合成酶基因。所有的黄瓜类胡萝卜素均通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成。一种黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因，其核苷酸序列SEQ ID的长度为1479bp，具有特有的核苷酸序列，一种由权利要求1所述的基因编码的多肽，它包含422个氨基酸，分子量为47393.507Da，等电点为6.545。在pH7.0时，电荷为0.777。具有特有的氨基酸序列，一种包含权利要求1所述基因的重组质粒pT-PSY，它的长度为4515bp，包含氨苄青霉素筛选标记；具有特有的核苷酸序列。本发明用于克隆黄瓜类胡萝卜素八氢番茄红素合成酶基因。
文档编号C12N9/00GK102776211SQ20111013052
公开日2012年11月14日 申请日期2011年8月24日 优先权日2011年8月24日
发明者劳杉杉, 秦智伟 申请人:东北农业大学