pTM系列质粒载体、其构建方法以及在布鲁菌表达外源基因中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明基因工程领域，具体地说，本发明设及到Ξ个用于布鲁菌突变基因功能性 回复研究用质粒pTMl-Cm、pTM2-Amp和pTM3-Km、一个用于在布鲁菌中对外源基因进行持续 高效表达的质粒PGH-6X化s，W及一个用于在布鲁菌中对外源基因进行四环素诱导型可控 表达质粒pZT-6XHis。
【背景技术】
[0002] 布鲁菌病是一种呈世界范围流行的重要的人畜共患细菌性传染病，该病由布鲁菌 属细菌感染引起W。布鲁菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性球杆菌，感染动物主要引起 孕畜流产、死胎和公畜睾丸炎；感染人类主要引起波浪热、不孕不育，或转为慢性引起关节 炎等?。布鲁菌感染可导致严重的发病率、重大的经济损失W及引发重要的公共卫生安全 问题。该病主要呈地方性流行?。布鲁菌感染的一个重要特点是细菌定植于宿主的网状内 皮组织系统。不同于常规致病菌，布鲁菌没有典型的毒力因子，如外毒素、溶细胞素、芙膜、 菌毛、质粒、溶源性隧菌体、药物抵抗形式、抗原变异W及内毒素特性脂多糖结构等，其毒力 主要体现在入侵宿主细胞和在胞内增殖的能力η53。
[0003] 目前鉴定布鲁菌未知的毒力相关因子依然是研究的热点，随着分子生物学技术的 发展，各种新的高通量技术用来筛选布鲁毒力相关因子，如转座子随机突变、DNA忍片、蛋白 质组学等W ?。迄今已报道与布鲁菌毒力相关的基因有245个W，然而，除了脂多糖、四型 分泌系统、BvrS/BvrR双组份调控系统和环β -1，2-葡聚糖等外Μ 1?，大多数已报道布鲁菌 毒力相关因子的功能并不十分清楚。
[0004] 布鲁菌毒力因子的研究需要对祀基因进行缺失株的构建，基因的回补，基因的过 量表达W及可控性表达等技术，而运些技术都是通过一系列质粒作为载体来实现的。目前 用于布鲁菌基因功能研究的常用载体为地BR1-MCS，该质粒是一种中拷贝的广宿主质粒，适 合多种细菌缺失株的基因回补研究^/53。然而，pBBRl-MCS质粒分子量大、拷贝数低，在用 于祀基因的功能性互补试验、持续过量表达或可控表达研究中有所限制。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供W地BR1-MCS质粒Μ的复制起始位点为基础，构 建用于布鲁菌基因功能研究的ρΤΜ系列质粒载体。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述系列质粒载体的构建方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供上述系列质粒载体在用于布鲁菌表达外源基因中的 应用。
[000引本发明首先构建分别载有氯霉素（Cm)抗性基因、氨节青霉素（Amp)抗性基因和卡 那霉素（Km)抗性基因的Ξ个质粒pTMl-Cm、pTM2-Amp和pTM3-Km。随后WpTMl-Cm为骨架， 构建了持续表达质粒PGH-6X化SW及诱导型表达质粒PZT-6X化S。该系列质粒的发明将 在后续布鲁菌基因功能研究中发挥重要的作用。构建5个质粒载体测序结果见序列表。
[0009] 本发明pTM系列质粒中的pTMl-Cm质粒载体，具有SEQIDNO. 1所示的核巧酸序 列。
[0010]所述pTMl-Cm质粒载体，W地BR1-MCS、pR326[ie]和pCold质粒灯akara)为模板， 采用如下引物对进行扩增：
[0011]TM01 :5,-GGAATTCCATATGGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTG-3'（SEQIDNO. 6)，
[0012] TM02 :5' -CATCAAGCTCTAGTTCGGTGGCGGCCGCATAGTCTGGAACAGCGCACTT-3'(沈QID NO. 7),
[0013]TM03 :5, -AAGTGCGCTGTTCCAGACTATGCGGCCGCCACCGAACTAGAGCTTGATG-3'（SEQID NO. 8),
[0014]TM04 :5, -ATTTGGGTGCAATGAGAATGGACGTCTAATTCGATGGGTTCCGAGG-3'(SEQID NO. 9), 阳01引 TM05 :5' -CCTCGGAACCCATCGAATTAGACGTCCATTCTCATTGCACCCAAAT-3'(SEQID NO. 10)，
[0016]TM06 :5, -GAATTCCCATATGGAGCTCGGTACCCTCG-3'（沈QIDNO. 11)。 阳017] 本发明所述pTMl-Cm质粒载体的构建方法，包括如下步骤： 阳0化]WpBBRl-MCS质粒为模板，WTM01和TM02为引物，PCR扩增质粒的r巧序列；W PR326质粒为模板，TM03和TM04为引物，PCR扩增Cm抗性基因片段；WpCold质粒为模板， TM05和TM06为引物，PCR扩增质粒的MCS-终止子序列。胶回收W上PCR产物片段。然后， WCm片段和MCS-终止子片段为模板，采用引物TM03和TM06为引物，进行一轮融合PCR反 应，所得片段胶回收后，与PCR扩增获得rep序列共同作为模板，WTM01和TM06为引物，进 行第二轮融合PCR，所得片段胶回收后，经限制性酶NdeI酶切和T4DNA连接酶进行自连接 成环，构建成pTMl-Cm质粒，质粒转化至大肠杆菌D册α进行扩增。
[0019] 本发明pTM2-Amp质粒载体，具有SEQIDNO. 2所示的核巧酸序列。
[0020] 所述pTM2-Amp质粒载体，WpBBRl-MCS、pUC19 (Invitrogen)和pCold质粒为模 板，采用如下引物对进行扩增：
[0021] TM01 :5, -GGAATTCCATATGGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTG-3'（SEQIDNO. 6)，
[0022] TM06 :5, -GAATTCCCATATGGAGCTCGGTACCCTCG-3'（沈QIDNO. 11)，
[0023]TM07 :5' -CGTATCACGAGGCCCTTTCGTCGCGGCCGCATAGTCTGGAACAGCGCACTT-3(沈QID NO. 12)，
[0024]TM08 :5，-AAGTGCGCTGTTCCAGACTATGCGGCCGCGACGAAAGGGCCTCGTGATACG-3,（沈QID NO. 13)，
[0025]TM09 :5' -ATTTGGGTGCAATGAGAATGGACGTCCTACGGGGTCTGACGCTCAGTG-3'(沈QID NO. 14)，
[0026] TMIO :5' -CACTGAGCGTCAGACCCCGTAGGACGTCCATTCTCATTGCACCCAAAT-3' （SEQ ID NO.巧）。
[0027] 本发明pTM2-Amp质粒载体的构建方法，包括如下步骤： 阳02引 WpBBRl-MCS质粒为模板，TM01和TM07为引物，PCR扩增rep区序列，WpUC19质 粒为模板，TM08和TM09为引物，PCR扩增Amp抗性基因，WpCo1d质粒为模板，TM10和TM06 为引物，PCR扩增MCS-终止子区序列。抗性基因片段和MCS-终止子区序列为模板，TM08和TM06为引物，进行一轮PCR，胶回收一轮融合片段，与PCR扩增获得rep序列共同作为模板， TM01和TM06为引物，进行二轮融合PCR反应，将二轮融合PCR产物胶回收，NdeI酶切后， T4连接酶自连接，构建成pTM2-Amp质粒。
[0029] 本发明的pTM3-Km质粒载体，具有SEQ ID NO. 3所示的核巧酸序列。
[0030] 所述的pTM3-Km质粒载体，W地BR1-MCS、祀T28a(Novagen)和pCold质粒为模板， 采用如下引物对进行扩增：
[0031]TM01 :5, -GGAATTCCATATGGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTG-3'（SEQIDNO. 6)，
[0032]TM06 :5, -GAATTCCCATATGGAGCTCGGTACCCTCG-3'（沈QIDNO. 11)，
[0033]TMll:5，-CACCACTTCAAGAACTCTGTAGGCGGCCGCATAGTCTGGAACAGCGCACTT-3,（SEQID NO. 16)，
[0034]TM12 :5'-AAGTGCGCTGTTCCAGACTATGCGGCCGCCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTG-3'(沈QID NO. 17)，
[0035]TM13 :5, -ATTTGGGTGCAATGAGAATGGACGTCCAGGTGGCACTTTTCGGGGA-3'(SEQID NO. 18)，
[0036] TM14 :5' -TCCCCGAAAAGTGCCACCTGGACGTCCATTCTCATTGCACCCAAAT-3'(SEQID NO. 19)。 阳037] 本发明所述的pTM3-Km质粒载体的构建方法，包括如下步骤： 阳03引 WpBBRl-MCS质粒为模板，TM01和TM11为引物，PCR扩增r巧区序列，W祀T28a质 粒为模板，TM12和TM13为引物，PCR扩增Km抗性基因，WpCold质粒为模板，TM14和TM06 为引物，PCR扩增MCS-终止子区序列。抗性基因片段和MCS-终止子区序列为模板，TM12和 TM06为引物，进行一轮PCR，胶回收一轮融合片段，与PCR扩增获得rep序列共同作为模板， TM01和TM06为引物，进行二轮融合PCR反应，将二轮融合PCR产物胶回收，NdeI酶切后， T4连接酶自连，构建成pTM3-Km质粒。
[0039] 本发明的持续表达质粒pGH-6X化s，具有SEQIDN0.4所示的核巧酸序列。 W40] 所述持续表达质粒PGH-6X化S，W流产布鲁菌S2308基因组为模板，WpTMl-Cm为 骨架，采用如下引物对进行扩增：
[0041]groE-F:5, -GGGGTACCCCGCTGTTCGCGCAAAAACGCCA-3'（沈QIDNO.20)，
[0042]groE-R:5，-CGGGATCCATGATGATGATGATGGTGCATGGTATAACCCTTGGTGTTATAGACGTT-3' 佛QIDNO. 21)。
[0043] 本发明所述pGH-6X化s质粒载体的构建方法，包括如下步骤：
[0044] W流产布鲁菌S2308基因组为模板，g