专利名称：广宿主打孔质粒载体、其构建方法及在制备菌蜕中应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种质粒载体，尤其涉及一种广宿主打孔质粒载体及其构建方法， 本发明还涉及广宿主打孔质粒载体在制备支气管败血波氏杆菌菌蜕中的用途，属于 基因工程领域。
背景技术：
"Bacterial Ghost"(细菌菌蜕)是一种没有细胞浆和核酸的空细菌体。将PhiX174 噬菌体E裂解基因在细菌中表达，该基因编码蛋白在细菌细胞膜和胞壁上可形成穿 膜隧道，在渗透压的作用下使菌体破裂，细菌胞内细胞浆和核酸成分通过此隧道被 排出，形成一种空的细菌外壳，即为"Bacterial Ghost"。 bacterial ghost是由内膜 (cytoplasmic membrane), 胞^炎间隙(periplasmic space)禾口夕卜月莫(outer membrane)纟且成， 因此细胞壁在很大程度上被完整保存下来。在有些菌株的外膜上还有一层S — layer， 也成为bacterial ghost的成分之一。Bacterial Ghost本身可作为一种很好的疫苗，因 为这种形式保留了和活菌一样的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白，而外膜含有天然的 免疫细胞通过模式识别受体识别的高度保守结构PAMP(pathogen-associated molecular patterns),例如脂多糖，肽聚糖，CPG， OmpA,菌毛等，能有效地被DC和 巨噬细胞所吞噬。目前，ghost通过静脉、皮下、气体等途径免疫己经在小鼠、兔子、 猪等动物模型中取得了良好的免疫保护效果。用A p/em"印"e"mom'ae ghosts气体免 疫接种猪，诱导了针对Ap/wra;^wmomhe引起的胸膜肺炎的完全保护。霍乱菌 ghost(VCG)经皮下注射小鼠诱导血清产生高水平的抗霍乱特异性IgG抗体。同时显 示，针对VCG的抗体足以保护新生小鼠免遭霍乱弧菌的感染。另夕卜，Bacterial Ghost 还可以用作一种极好的递送系统，通过在细菌裂解之前对细菌进行外膜的人工改 造，将外来抗原，核酸或药物等其它成分锚定于胞膜的内、外侧，或充于胞浆周质。 这样制备的重组ghost拥有完好的，天然的细菌外膜结构，能同时激发体液和细胞 免疫应答。其菌毛等表面黏附结构，又使之能靶向黏附在特异性的组织，如胃肠道 和呼吸道的黏膜表面，进而较易被机体吞噬细胞，如PP结(Peyer， s Patches)的M
细胞所识别捕获，故而可有效递送疫苗抗原至黏膜表面和诱发相关黏膜免疫应答。 Eko等人将沙眼衣原体(C.加c/wmato)抗原在霍乱菌的内膜表达，然后裂解制备的重 组ghost(VCG)有效地激发了生殖道黏膜的Thl型免疫应答，现在正在着手进入临床 实验。与传统的原核系统表达蛋白相比，重组bacterial ghost有几大优势(l)重组 蛋白被整合在一个具有高度免疫原性的环境中；(2)对蛋白的大小要求范围宽泛，但 蛋白的分子量最好在2000到200,000Da之间;(3)重组蛋白被直接表达后整合到细菌 的膜上，裂解后就能直接用于免疫动物，而不必要象以前制备免疫原时要先分离纯 化重组蛋白；(4)整合在细胞壁的重组蛋白是以天然的构象，所以保持了它原有的活 性形式。而一般基因重组的蛋白通过原核系统大都以包涵体的形式表达，只能通过 变性、复性的方法在一定程度上恢复蛋白活性。(5)ghost的制备相对简单，可用发 酵技术获得，而不需进行复杂的纯化工作；可以冻干的形式贮存于室温。
溶解基因E的表达可在人pL/pR-c1857或在lacPO-lacIq启动阻遏系统的转录控 制下完成。 一些含有不同抗性标记、复制起始区和基因E表达控制的特异性溶解质 粒已经被构建出来。ApR启动子和温敏阻遏物c1857在30。C以下能抑制基因E的 表达，高于30OC会导致阻遏物cI857热灭活而诱导E基因表达。为了制备ghost， 细菌须在28。C条件下生长到对数生长期，然后升温到42。C诱导其溶解。
E蛋白介导的溶解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌、肠 炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、支气管败血博德特氏杆菌、幽门螺旋杆菌、霍乱 弧菌、胸膜肺炎放线杆菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、绿脓 杆菌、恶臭假单胞菌等。范围如此之大说明了只要E溶解盒被引入到适当的载体中， E蛋白介导的溶解可能会在每个革兰氏阴性菌中发生。
目前，国外在制备革兰氏阴性菌的ghost菌蜕时使用的打孔质粒载体大多来源 于目的菌株与大肠杆菌的穿梭质粒载体，在此基础上构建的打孔质粒载体一般只能 用于制备目的菌株或亲缘关系较近菌种的ghost菌蜕，应用范围相对比较狭窄。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种应用范围相 对比较宽的广宿主打孔质粒载体。
本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种广宿主打孔质粒载体pBBR-E，温敏调控基因c1857 (SEQIDN0.6)、噬菌
体溶菌基因E (SEQ ID NO. 5)和广宿主质粒pBBR4-MCS组成。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述广宿主打孔质粒载体 pBBR-E的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种构建广宿主打孔质粒载体pBBR-E的方法，包括
以噬菌体PhiX174双链DNA为模板，以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2为引物 进行PCR扩增，得到溶菌基因E;将溶菌基因E纯化后用T4DNA连接酶与经&oRI 和I双酶切消化的pBV220载体相连接，得到打孔质粒载体pBV-E;以打孔质 粒载体pBV-E为模板，以SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4为引物进行PCR扩增，将 PCR扩增产物纯化后用5azfl I和I双酶切，然后与同样双酶切的广宿主质粒 pBBR4-MCS相连接，即得。
本发明所要解决的再一个技术问题是利用所构建的广宿主打孔质粒载体 pBBR-E应用于制备支气管败血波氏杆菌菌蜕。
本发明所要解决的再一个技术问题是通过以下技术方案来实现的
广宿主打孔质粒载体pBBR-E在制备支气管败血波氏杆菌菌蜕中的应用，包 括将广宿主打孔质粒载体pBBR-E电击转化到支气管败血波氏杆菌I相菌"A50-4" 菌株感受态细胞中；转化后涂布Amp+的改良鲍姜氏琼脂平板(10%脱纤绵羊血)， 转化子通过菌落PCR进行鉴定；将含有广宿主打孔质粒载体pBBR-E的支气管败血 波氏杆菌接种到改良鲍姜氏(50pg/mL氨苄青霉素)液体培养基中，28r过夜震荡 培养(220 r/min)，然后转接于含50 y g/mL氨苄青霉素的改良鲍姜氏液体培养基 中，28t:震荡培养至0D6。。nm达0.5左右；取出100ul培养物备用，将剩余培养物迅 速调高到42'C培养以诱导E基因表达，继续培养5-7小时；取诱导前后的培养物各 100 u 1适当稀释后涂鲍姜氏琼脂平板进行活菌CFU检测；溶菌结束后形成的ghost 菌蜕用PBS洗涤3次，冻干保存；
本发明打孔质粒载体pBBR-E是基于广宿主范围的质粒载体pBBR4-MCS的基础 上构建而成，该打孔质粒载体可以在大多数革兰氏阴性菌中复制并表达溶菌基因E， 从而制备相应菌株的ghost菌蜕。
本发明打孔质粒载体pBBR-E可应用于制备支气管败血波氏杆菌Ghost菌蜕， 由于本发明打孔质粒载体PBBR-E是基于广宿主范围的质粒载体pBBR4-MCS构建而 成的，由于后者是来源于支气管败血波氏杆菌，所以在制备气管败血波氏杆菌Ghost菌蜕时裂解效率较高，可高达99. 9997%，比国外高出了约4个数量级。
图1 本发明广宿主打孔质粒载体pB服-E的构建示意图2支气管败血波氏杆菌Ghost (菌蜕)的透射电镜观察结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料
支气管败血波氏杆菌I相菌"A50-4"菌株为本研究室自藏(该菌株也可从普 通生物试剂公司购买得到)，噬菌体PhiX174购于Proraega (北京)生物技术有限公 司。质粒pBV220的构建过程可按照以下文献构建张智清，姚立红，侯云德，含 PrPl启动子的原核高效表达载体的组建及其应用，病毒学报，1990， 6 (2)， 111 一116。
广宿主质粒pBBR4-MCS可按照以下文献构建得到Kovach ME et al. 〃pBBRlMCS: A broad-host-range cloning vector〃， Biotechniques 16:800-802(1994)。
实施例1广宿主打孔质粒载体pBBR-E的构建 1.1噬菌体PhiX174溶菌基因E的克隆
根据GenBank中噬菌体PhiX174溶菌基因E的编码序列设计引物 Lysis E-U: 5'- AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG -3' (SEQ ID NO. 1) Lysis E-L: 5'- AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG -3， (SEQ ID NO.1) 上、下游引物5'端分别引入了限制性酶切位点fcoR I和Ss/bH I，由上海生工 合成。以噬菌体PhiX174双链DNA为模板扩增溶菌基因E: PCR扩增反应体系为50 uL，其中MgS(X2 mM，上、下游引物各1 u M， dNTP 200 u M， 10x Tsg buffer, 7a,DNA聚合酶2 U(TaKaRa)，模板DNA10 ng。 PCR反应程序为:95°C预变性5 min，94°C 30 s， 59°C 30 s， 72°C 30 s， 30个循环，72°C 5 min。 PCR产物经凝胶电 泳后用胶回收试剂盒回收，然后用&oR I和^jthH I进行酶切，用胶回收试剂盒回 收。
1. 2打孔质粒载体pBV-E的构建
将纯化的溶菌基因E用T4 DNA连接酶(TaKaRa)与经￡coR I和As/hH I双酶切 消化的pBV220载体相连接，16。C过夜连接并热激转化入大肠杆菌TG1感受态细胞， 经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，命名为 pBV-E，对克隆的溶菌基因E进行测序鉴定。
1. 3打孔质粒载体pBBR-E的构建
根据pBV220质粒载体上温敏调控基因cI857的序列设计引物cI-U，根据溶菌 基因E的序列设计引物E-L，序列如下
cl-U: 5， - GGGGGGATCCTCAGCCAAACGTCTC -3， ( SEQ ID NO. 3) E-L: 5， - ACTGTTGAGCTCTCACTCCTTCCGCA -3， ( SEQ ID NO.4) 上、下游引物5'端分别引入了限制性酶切位点ifef I和5"sc I，由上海生工合 成。以打孔质粒载体pBV-E为模板，cI-U和E-L为引物进行PCR扩增，所得PCR产 物包括温敏调控基因cI857以及溶菌基因E，命名为cI+E。 PCR扩增反应体系为 50 uL，其中MgS04 2 mM，上、下游引物各1 y M， dNTP 200 y M， 10x buffer， LA n^ DNA聚合酶2 U (TaKaRa)，模板DNAIO ng。 PCR反应程序为95°C预变 性5 min， 94°C 30 s, 59°C lmin， 72°C 1. 5min， 30个循环，72°C 10 min。 PCR 产物cI+E纯化后用SazH I和5"ac I双酶切，然后与同样双酶切的广宿主质粒 pBBR4-MCS相连接，热激转化入大肠杆菌TGI感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性 的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，命名为pBBR-E，对克隆的温敏调控 基因cI857以及溶菌基因E进行测序鉴定。
实施例2支气管败血波氏杆菌ghost的制备
将广宿主打孔质粒载体pBBR-E电击转化到支气管败血波氏杆菌I相菌"A50-4" 菌株感受态细胞中，电击感受态的制备参照Sambrook等的方法(分子克隆实验指 南)，电穿孔仪(Micro—pulser， Bio-Rad, USA)的电击参数为12.5 kV/cm、 200
Q、 25uf、 5. 0ms，转化后涂布A即+的改良鲍姜氏琼脂平板(10%脱纤绵羊血)， 转化子通过菌落PCR进行鉴定。将含有广宿主打孔质粒载体pBBR-E的支气管败血 波氏杆菌接种到改良鲍姜氏(50ug/mL氨苄青霉素)液体培养基中，28。C过夜震荡 培养(220 r/min)，然后转接1-2 mL于50mL含50u g/mL氨苄青霉素的改良鲍姜 氏液体培养基中，28t:震荡培养至0D6i达0.5左右。取出lOOul培养物备用，将 剩余培养物迅速调高到42"C培养以诱导E基因表达，继续培养5-7小时。取诱导前 后的培养物各100 u 1适当稀释后涂鲍姜氏琼脂平板进行活菌CFU检测。溶菌结束 后形成的ghost菌蜕用PBS洗涤3次，冻干保存，并对冻干后的菌蜕进行活菌CFU 检测。
检测结果溶菌前后的培养物从2.6xl()9下降到6.8xl03(CFU/ml)，溶菌灭活效 率达99. 9997%。
试验例l 支气管败血波氏杆菌Ghost (菌蜕)的透射电镜观察
将实施例2中42°。中诱导培养5-7小时的菌液4 000 g离心10min，以2. 5 % 戌二醛固定细菌，置4 r下2h， 0.01mo1/ L PBS洗涤3次，离心后经四氧化锇 再固定、乙醇逐级脱水、包埋剂包埋等步骤处理后进行电镜观察。结果见图2。
序列表
SEQUENCE LISTING 〈110〉中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所 <120〉广宿主打孔质粒载体、其构建方法及在制备菌蜕中应用 〈130〉 P658 〈160> 6
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
〈213〉 phage E
〈400> 1
agggaattca tggtacgctg gactttgtgg 30
〈210> 2
<211> 27
<212> DNA
〈213〉 phage E
〈400〉 2
aggggatccg agctctcact ccttccg 27
〈210〉 3
<211〉 25
<212〉 DNA
<213> phage E
<400> 3
ggggggatcc tcagccaaac gtctc 25
〈210〉 4
<211> 26
〈212〉 DNA
<213> phage E
<400> 4
actgttgagc tctcactcct tccgca 26
<210> 5
<211> 276
〈212〉 DNA
〈213> phage E
<400> 5
atggtacgctggactttgtgggataccctcgctttcctgctcctgttgagtttattgctg60
ccgtcattgcttattatgt.tcatcccgtca acattcaaacggcctgtctcatcatggaag120
gcgctgaattt3Cgg3333Cattattaatggcgtcgagcgtccggttaaagccgctgaat180
t.gttcgcgtttacctt.gcgtgtacgcgcaggasacactgacgttcttactgacgcagaag240
犯aacgtgcgtcaaaemttacgtgcgg犯ggagtga276
〈210〉 6
<211〉 1146
<212〉 DNA 〈213〉
〈400〉 6
tcagccaaac gtct.cttcag gccactgact agcgataact ttccccacaa cggemcaact 60 ctcattgcat gggatcattg ggtactgtgg gtttagtggt tgta朋aaca cct.gaccgct 120
9 atccctgatc3gtttcttgaaggtaaactc3tC3CCCCC3agtctggctatgcagsaatc180
acct.ggctcaacagcctgctcagggtcaacgagaatt.aacgaaagcUgg240
Cttgg3gCCtgttggtgcggtcatgg朋ttaccttcaacctcaagccagaatgcagaatc300
actggcttttttggttgtgcttacccatctctccgcatcacctttggtaaaggttctaag360
cttaggtgagaacatccctgcctgaacatggggtactcatactcacttct420
aagtgacggctgC3t3Ct犯ccgcttcatacatctcgtagatttctctggcgattgaagg480
gctaaattcttc犯cgcta3ctttgagaatttttgtaagc犯tgcggc.gttat犯gc3tt540
t犯tgcattg3tgCC3tt犯ataaagcaccaacgcctgactgccccatccccatcttgtc600
tgcgacagattcctgggataagccaagttcatttttctttttgcttt犯g660
gCg3CgtgCgtcctcaagctgctcttgtgttaatggtttcttttttgtgctcatacgtta720
aatctatcaccgcaagggatceiccgtgcgtgttgactattttaxxtctgg780
ggttgcatgtttgtatggaacaacgcataaccctgaaaga840
ttatgcaat.gcgctttgggcagct犯agatctctcacctaccaaacaatg■
cccccctgcaa^aataaattcatataaaaaacatacagataaccatctg960
ttatctctggcggtgttgacctggcggtgat,actgagcac3tcagcagg31020
cacactgaccaccstgaaggtgacgctcttaa犯attaaggggC3gCatt1080
ggctttggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggttaaaaattaaggag1140
gaattc114权利要求
1、一种广宿主打孔质粒载体pBBR-E，其特征在于由温敏调控基因cI857、噬菌体溶菌基因E和广宿主质粒pBBR4-MCS组成。
2、 一种构建权利要求1的广宿主打孔质粒载体pBBR-E的方法，包括以噬 菌体PhiX174双链DNA为模板，以SEQ ID NO. 1禾n SEQ ID NO. 2为引物进行PCR扩 增，得到溶菌基因E;将溶菌基因E纯化后用T4 DNA连接酶与经AcoR I和^mH I 双酶切消化的pBV220载体相连接，得到打孔质粒载体pBV-E;以打孔质粒载体pBV-E 为模板，以SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物纯 化后用I和fee I双酶切，然后与同样双酶切的广宿主质粒pBBR4-MCS相连 接，即得。
3、权利要求1的广宿主打孔质粒载体pBBR-E在制备支气管败血波氏杆菌菌蜕 中的应用，包括将广宿主打孔质粒载体pBBR-E电击转化到支气管败血波氏杆菌 I相菌"A50-4"菌株感受态细胞中；转化后涂布Amp+的改良鲍姜氏琼脂平板，转 化子通过菌落PCR进行鉴定；将含有广宿主打孔质粒载体pBBR-E的支气管败血波 氏杆菌接种到改良鲍姜氏液体培养基中，28"C过夜震荡培养，然后转接于含 50y g/mL氨苄青霉素的改良鲍姜氏液体培养基中，28。C震荡培养至006。。。 达0. 5左 右；取出100ul培养物备用，将剩余培养物迅速调高到42。C培养以诱导E基因表 达，继续培养5-7小时；取诱导前后的培养物各100ul适当稀释后涂鲍姜氏琼脂 平板进行活菌CFU检测；溶菌结束后形成的ghost菌蜕用PBS洗涤3次，冻干保存。
全文摘要
本发明公开了一种广宿主打孔质粒载体pBBR-E及其构建方法，本发明还公开了该广宿主打孔质粒载体pBBR-E在制备支气管败血波氏杆菌菌蜕中的用途，属于基因工程领域。本发明广宿主打孔质粒载体pBBR-E由温敏调控基因cI857、噬菌体溶菌基因E和广宿主质粒pBBR4-MCS组成。本发明构建的打孔质粒载体pBBR-E是基于广宿主范围的质粒载体pBBR4-MCS的基础上构建而成，可以在大多数革兰氏阴性菌中复制并高效表达溶菌基因E，在制备气管败血波氏杆菌Ghost菌蜕时裂解效率较高，可高达99.9997％，比现有技术高出了约4个数量级。
文档编号C12N15/63GK101182536SQ20071019375
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月26日 优先权日2007年11月26日
发明者刘思国, 刘惠芳, 常月红, 王春来 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所