专利名称：一种新型高效重组质粒载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种质粒载体的构建方法，并且在实际应用中已经取得了初步成效， 有广阔的应用前景，属于基因工程中的原核表达系统。
背景技术：
质粒是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。 其特点如下质粒具有自我复制功能、染色质以外的双价闭合环状DNA、它的DNA分子上有 一个或多个限制性核酸内切酶切割位点、它的分子上还有特殊遗传标记基因。现在分子生 物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工 改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同类型的质粒载体，近年来发展得很快， 新的有特定用途的质粒不断被创建。用于生产重组蛋白的质粒载体很多都包含有纯化标签。纯化标签的运用是近年来 发展起来的基因表达策略，并且已经被广泛应用。它的运用极大地方便了对目的蛋白的纯 化。常见的标签有多聚精氨酸、多聚组氨酸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等。GST标签是最早 使用的亲和标签，目标蛋白加于GST的C端，再利用谷胱甘肽亲和层析介质进行纯化。试验 中发现GST标签能用于增加可溶性表达，某些目的蛋白还依赖于GST的协助进行正确地折 叠，因此GST标签也可以认为是一种分子伴侣来增强蛋白的表达。但是纯化中所用GST亲 和层析介质却比较昂贵，且还有使用寿命短的缺点。多聚组氨酸标签是基于组氨酸和金属 离子特异结合的金属螯合层析技术，其具有分子量小、对目的蛋白的结构和功能影响小、所 用层析介质廉价、使用寿命长，可应用于多种表达系统，纯化的条件温和、可以和其它的亲 和标签一起构建双亲和标签等特点。因此综合两种标签的特性，构建一种既含有GST标签 作为分子伴侣又含有多聚组氨酸纯化标签的载体具有很重要的实际意义。另外质粒载体还常含有筛选标记。筛选标记包括氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、 四环素，红霉素和氯霉素抗性等。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰。由 于载体的筛选标记不同，所用的受体细胞也不同。同时抗性基因的选择，还要考虑到其残余 对目的蛋白終产品是否产生影响，如当青霉素残留在目的蛋白中时，将该蛋白产品注射到 人体内有可能产生过敏反应。在上述筛选标记中，卡那霉素是国内外一致认为比较好的筛 选标记物。
发明内容
本发明的一个方面，涉及一种高效的基因工程融合表达质粒，其为SEQ ID N0:1所 示的pNL-06质粒。本发明的特点是，在质粒中编码融合蛋白N末端标签的基因序列中，既含有GST标 签作为分子伴侣又含有多聚组氨酸纯化标签，并且将多聚组氨酸纯化标签插在GST标签N 端，让其暴露出来，更有利于目的片段的纯化。同时为了让强碱性的多聚组氨酸能在融合蛋 白N末端高效表达，在多聚组氨酸序列的两端加上调和序列。另外本载体上的卡那霉素抗性基因的选择，使得在生物医药的生产过程中，终产品引起人体过敏反应的可能性降到最 低，并且使得纯化工艺难度与成本大大下降。本发明有望成为一种新型实用载体取代现今 常用的载体。本领域普通技术人员知晓，所述质粒可以通过基因重组的方法或者全基因合成的 方法制备。在本发明中，所述质粒是通过全基因合成的方法获得的。在本发明的一个实施方案中，通过如下方法获得重组质粒pNL-06，包括如下步 骤1)载体的构建首先根据发明思路和原核表达载体的构建原则，选定组成质粒载体的各个组成 元件启动子、蛋白标签、抗性基因、原核内自主复制序列等，并排好各自的位置。再参照 "GENE BANK”中各个组成元件的基因序列和相关序列在实际应用中的情况，设计出重组质 粒pNL-06的碱基序列。然后采用全基因合成的方法合成重组质粒pNL-06。经质粒全基因 测序，构建的重组载体基因为5231bp，结构图见图1。2) pNL-06载体在重组胸腺素α 1 (Τ α 1)的表达及分离纯化中的应用将Τα 1结构基因序列插入到pNL-06载体中，得到重组子转化到表达宿主菌BL21， 经表达筛选出高表达基因工程菌，然后经发酵，得到目的蛋白高表达的工程菌。高压均质机 破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液用镍离子亲和柱纯化，洗脱目的前 体蛋白并用Si^phadex G-25层析介质脱盐后，肠激酶酶切，再通过阴离子交换层析柱进一步 纯化，得到最终蛋白纯度大于98%的终产物。同时将Ta 1结构基因序列插入到商业化表达 质粒PGEX-4T-1中，用于作为研究对照。3) pNL-06载体在重组胸腺素β 4 (Τ β 4)衍生物的表达及分离纯化中的应用将T β 4结构基因序列插入到pNL-06载体中，得到重组子转化到表达宿主菌，然后 经发酵，得到目的蛋白高表达的工程菌。高压均质机破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白 上清液，将上清液用镍离子亲和柱纯化，洗脱目的前体蛋白并用S^hadex G-25层析介质脱 盐后，凝血酶酶切，再通过阴离子交换层析柱进一步纯化，得到最终蛋白纯度大于98%的终 产物。同时将T β 4结构基因序列插入到商业化表达质粒PGEX-4T-1中，用于作为研究对照。
图1NL-06的构建示意2胸腺素a 1的发酵表达SDS-PAGE电泳图谱(pGEX_4T_l) :A，分子量Marker ； B，诱导后；C，诱导前。图3胸腺素α 1的发酵表达SDS-PAGE电泳图谱(pNL_06) :A，蛋白分子量Marker ； B，诱导前；C，诱导后。图4胸腺素α 1纯化后电泳图谱Α，蛋白分子量Marker ；B、C、D，三批纯化胸腺素 α 1样品。图5胸腺素α 1的纯化后的HPLC图谱。图6胸腺素α 1生物学活性图片Α，阴性对照；B，胸腺素α 1。图7胸腺素β 4的发酵表达SDS-PAGE电泳图谱(pGEX_4T_l) :A，分子量Marker ； B，诱导后；C，诱导前。
图8胸腺素β 4的发酵表达SDS-PAGE电泳图谱(pNL_06) :A，蛋白分子量Marker ； B，诱导前；C，诱导后。图9胸腺素β 4的纯化后的SDS-PAGE电泳图谱Α，蛋白分子量Marker ；B、C、D，三 批纯化胸腺素β 4样品。图10胸腺素β 4的纯化后的HPLC电泳图谱。图11胸腺素β 4生物学活性图片Α，阴性对照；B，胸腺素β 4。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这个实例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。实例lpNL-06载体的构建首先根据发明思路和原核表达载体的构建原则，选定组成质粒载体的各个元件 启动子、蛋白标签、抗性基因、原核内自主复制序列等，并排好各自的位置。再参照“GENE BANK”中各个组成元件的基因序列和相关序列在实际应用中的情况，设计出重组质粒 PNL-06的碱基序列。经转化、筛选成功的重组子命名为pNL-06(见图1)，经质粒全基因测 序，构建的重组载体基因为5231bp。该质粒具有SEQ ID NO :1所示核酸序列，表1为序列 表中的基因序列的各构成元件说明。表1.序列表中的基因序列的各段说明
权利要求
1.一种新型的高效原核融合蛋白表达载体。其特征为包含Tac启动子、含有多聚组氨 酸和GST两种标签的基因序列，又含有卡那抗性基因、大肠杆菌自主复制序列，该质粒具有 SEQ ID NO 1所示核酸序列。
2.按照权利要求1所述的载体，其特征在于该载体携带有表达GST标签的基因序列。
3.按照权利要求1所述的载体，其特征在于该载体GST标签基因序列的5’端，携带有 含6个组氨酸的纯化标签对应的基因序列。
4.按照权利要求1所述的载体，其特征在于该载体带有卡那霉素抗性基因。
5.按照权利要求1所述的载体，其特征在于其为大肠杆菌表达载体。
6.按照权利要求1所述的载体，其特征在于该载体GST标签基因序列的3’端，携带有 肠激酶(EK)与凝血酶(Thrombin)酶切位点序列。
7.按照权利要求3所述的载体，其中，所述的含6个组氨酸片段的序列为 MGSSHHHHHHSSG 。
8.—种生产重组蛋白的方法，包括使用权利要求1所述的载体，应用在重组人胸腺素 α 1生产过程中。
9.一种生产重组蛋白的方法，包括使用权利要求1所述的载体，应用在重组人胸腺素 β 4生产过程中。
全文摘要
本发明是一种高效的原核表达载体。本发明的载体含有多聚组氨酸和GST两种标签，便于根据实际情况对表达产物的快速纯化，以及协助目的蛋白在工程菌胞内实现可溶性表达；本发明的载体同时还含有卡那抗性基因，使得在生物医药类目的蛋白的生产过程中，终产品引起人体过敏反应的可能性降到最低，并且使得纯化工艺难度与成本也大大下降。本发明对提高目的产物的纯化效率、降低成本具有重要的意义。
文档编号C12R1/19GK101993885SQ20091009123
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月17日 优先权日2009年8月17日
发明者刘国强, 汤晓闯, 聂李亚, 许松山, 赵娜娜, 马素永 申请人:北京诺思兰德生物技术股份有限公司