专利名称：蓝舌病病毒vp7基因重组表达质粒载体、vp7表达抗原以及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于制备蓝舌病病毒诊断试剂的生物制剂，尤其是能够对动物蓝舌病进行检测的生物制剂以及这种生物制剂的制备方法。
背景技术：
蓝舌病(Bluetongue，BLU)是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病毒(Bluetongue Virus，BTV)引起的，由库蠓传播的反刍动物的一种严重传染病。该病1905年在南非发生以来，给世界畜牧业和国际贸易产生重大影响。国际兽疫局(OIE)确定其为动物A类传染病。迄今共有25个血清型。其基因组含有10个分子量大小不一的双链RNA片段(dsRNA)，总共由19218个bp组成。BTV的10个片段双股RNA包裹于双层蛋白质衣壳内，编码7种结构蛋白(VP1~VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3A)，7种结构蛋白的4种形成双层蛋白衣壳，外壳主要由VP1和VP5构成，而内壳主要由VP3和VP7构成。VP7基因为保守片段，VP7携带有群特异性抗原决定簇，由病毒抗原决定簇产生的抗体多数是针对VP7的。因此，在BLU的群特异性血清抗体检测中，VP7作为首选的抗原。以群特异性抗原单克隆抗体和基因表达抗原为基础上的竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)，具有特异、敏感、稳定和安全的特点，试剂和试剂盒的制备和组装简便，易于商品化，是近年来广泛应用的抗体检测技术。
目前，BLU最常用的血清学诊断方法是竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)，c-ELISA具有快速、特异、敏感、简便和安全的优点，被广泛采用。通过组织培养方法，将病毒接种在细胞中大量繁殖，经过分离、纯化的病毒作为c-ELISA包被抗原，这种方法不仅操作繁锁，不稳定，产量低，成本高，而且有一定的生物安全隐患。另据报道，应用分子克隆和基因重组技术已在原核和真核系统中表达了VP7蛋白，但原核表达的蛋白抗原性差，真核表达的抗原提取烦琐、成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能稳定、高效表达具有良好抗原性的蓝舌病病毒VP7抗原基因重组表达质粒载体。
本发明的第二个目的在于提供可用于蓝舌病诊断的VP7重组表达抗原。
本发明的第三个目的在于提供上述重组表达载体以及VP7表达抗原的制备方法。
本发明所述的蓝舌病病毒VP7基因重组表达质粒载体命名为p BAD-B5，其编码VP7融合蛋白的核苷酸序列为
图1所示，所述BTV VP7基因DNA序列已经在GenBank中注册，注册号为AY386682。
本发明所述的蓝舌病病毒VP7基因重组表达质粒载体所获得的表达产物命名为VP7融合蛋白，其氨基酸序列为图2所示。
本发明所述的蓝舌病病毒VP7基因重组表达载体的制备方法由以下步骤组成一、将BTV编码群特异性抗原VP7基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中，构建VP7基因克隆重组质粒，进行核苷酸序列分析；二、亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体；三、转化TOP10细胞，经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定；四、筛选获得BTV VP7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆，即构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体。
本发明所述的蓝舌病病毒诊断基因重组表达质粒载体所获得的表达产物的制备方法由以下步骤组成一、将筛选获得的含有BTV群特异性抗原VP7表达重组质粒阳性克隆载体的工程菌株，接种于含100μg/mL Amp的LB培养基，37℃振荡培养12h；二、上述培养物按1％的体积接入含100μg/mL Amp的LB培养基，37℃振荡培养4h；三、在培养基中加入阿拉伯糖至最终浓度为0.02％，温度降至30℃，继续振荡培养，缓慢诱导表达5h；
四、收集菌液以4℃下5000r/min离心30min，将沉淀菌体按1∶10(W/V)悬浮于TE缓冲液，置冰水浴中300~400W反复超声破菌，每次15s，间隔15s；五、菌体裂解液以4℃下5000r/min离心30min，取上清液为粗提的BTV VP7重组融合蛋白；六、用ELISA试验测定BTV VP7重组融合蛋白抗原效价。
本发明的优点和积极效果为1、该表达载体生产的VP7为抗原的竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)，具有快速、特异、敏感、简便和安全的优点，克服了通过组织培养方法生产完整病毒作为c-ELISA包被抗原而造成的操作繁锁、不稳定、产量低、成本高、有生物安全隐患的缺点。
2、用pBAD/Thio-TOPO原核表达系统对蓝舌病病毒的VP7蛋白进行表达，生产的抗原以可溶性形式高效表达，融合蛋白有完全生物学活性。也克服了真核系统中表达VP7蛋白抗原的提取烦琐、成本高的缺陷，该方法生产VP7抗原具有简便、快捷和高效的特点。
3、该表达载体含有阿拉伯糖启动子，它的调控快速而灵敏。
4、用表达产物作为抗原进行c-ELISA方法具有较强的特异性和更高的敏感性，不与相关环状病毒发生交叉反应。包被的酶标板在4℃可以存放2个月，在-20℃可保存6个月以上。本试验生产的重组VP7蛋白抗原可以代替完整病毒作为c-ELISA检测用的标准抗原。
具体实施例方式
(一)蓝舌病病毒VP7抗原基因的克隆和表达重组质粒的构建根据BTV10型VP7基因序列，设计、合成一对引物，扩增长度为1044bp。VP7-P15’-GAC ACT ATC GCT GAC AGA GCA CT-3’ ，在S7基因的位置第21~43位；VP7-P25’-CAC ATA GGC GGC GCG TGC AAT AG-3’，在S7基因的位置第1064~1042位。PCR产物在10g/L琼脂糖上进行电泳检测。按照宝生物工程(大连)有限公司生产的pMD18-T载体试剂盒(产品号D504CA)使用说明书要求，回收纯化的PCR目的片段插入pMD18-T载体，转化E.Coli.JM109感受态细胞，PCR和测序鉴定，获得含有BTV-VP7基因1044bp片段的阳性克隆。该基因在GenBank登录号为AY386682。
从BTV VP7基因阳性重组质粒中亚克隆目的基因，设计引物时去除目的基因的起始密码子和终止子，使目的基因插入pBAD/Thio TOPO载体后表达融合蛋白，以提高特异性抗原的免疫原性和稳定性。PCR反应循环参数为94℃ 1min、65℃1min、72℃2min，30个循环，72℃延伸10min，取10μL PCR反应产物在10g/L琼脂电泳检测。按照Invitrogen公司生产的p BAD/TOPOThioFusionTM表达试剂盒(产品号K370-01)说明书要求，回收纯化后的目的片段连接插入p BAD/Thio-TOP载体，转化TOP10感受态细菌，在含100μg/mL Amp的LB培养基上选择培养24h。用鸡尾酒-PCR体系法高效、快速分析鉴定菌落，根据载体和目的基因上的酶切位点，用NCOI+ECORV双酶切鉴别出正向插入BTV VP7基因的重组质粒。对重组表达质粒中的插入片段进行序列测定，获得的重组子命名为p BAD-B5。在该载体中BTV VP7基因的编码序列全长为1044bp，其编码332个氨基酸。表达融合蛋白的N端是分子量为13kD的HP-Thioredoxin，C端是分子量为3kD的V5 epitope和6个组氨酸，中间是分子量为38.5 kD的BTV VP7蛋白，整个表达融合蛋白的分子量为54.5kD。
(二)大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备与转化、质粒的制备大肠杆菌TOP10感受态细胞制备，采用氯化钙制备法，具体方法参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1998)，第55-56页。只是采用由0.75mmol/LTris-HCl代替水为溶剂配制0.1mol/LCaCl2。感受态细胞的转化方法，参照上述参考文献进行。质粒的制备参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1998)，第26-28页，采用碱裂解法制备，用PEG沉淀法纯化。
(三)BTV VP7重组表达质粒载体在大肠杆菌中的诱导表达、重组蛋白抗原制备具体方法按照Guzman L M，Belin D和Carson M J等.《Tight Regulation，Modulation，and High-Level Expression by Vectors Containing the Arabinose PQADPromoter》.J.Bacteriol，1995，1774121-4130。将已转化p BAD-B5的TOP10细菌接种在含100μg/mL Amp的LB培养基中，37℃振荡培养12h；参照杨丽琛、常团结和陈宛新等《CpTI蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达及其纯化与活性测定》，生物工程学报，2003年第1期，第63-67页，制备含100μg/mL Amp的LB培养基，按1％的体积接入上述制备的种子菌液，37℃振荡培养4h，加入阿拉伯糖至最终浓度为0.02％，温度降至30℃，继续振荡培养，缓慢诱导表达5h，收集菌液以4℃下5000r/min离心30min，称量菌体湿重。将菌体按1∶10(W/V)悬浮于TE缓冲液，置冰水浴中300~400W反复超声破菌，每次15s，间隔15s，涂片染色镜检至完全裂解菌体，以4℃下5000r/min离心30min，取上清液为粗提的BTV VP7重组蛋白抗原。
(四)ELISA和琼脂扩散试验(AGID)检测按照花群义等《竞争酶联免疫吸附试验检测蓝舌病抗体的研究》，动物医学进展，2002年第2期，第66页至第69页。用上述方法制备表达菌株的重组蛋白粗提物和阴性对照菌株的粗提物，用BTV特异性抗血清和HRP-protein G进行酶联免疫吸附试验，测定表达菌株的重组蛋白粗提物和阴性对照菌株的粗提物中表达产物的特异性ELISA滴度，采用方阵滴定法测定最适包被抗原的浓度。
用经上述测定包被抗原浓度的重组蛋白作为包被抗原，按照花群义、周晓黎和徐自忠等《蓝舌病竞争酶联免疫吸附试验操作规程》(中华人民共和国出入境检验检疫行业标准(SN/T1165.1-2002))和贾建军、周晓黎和杨晶焰等《蓝舌病琼脂免疫扩散试验操作规程》(中华人民共和国出入境检验检疫行业标准(SN/T1165.2-2002))所述进行蓝舌病c-ELISA方法和AGID试验检测。
(五)按上述(三)所制备BTV VP7重组抗原方法，100mL含100μg/mL Amp的LB培养基可获得约30mL蓝舌病竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)包被抗原和1mL琼脂免疫扩散试验(AGID)抗原。
(六)按上述(四)方法，BTV VP7重组抗原试剂在全国检验检疫系统相关部门和动物防疫部门进行了应用，制备并提供给应用单位近13万头份，证明VP7重组抗原在诊断蓝舌病方面具有较强的特异性和更高的敏感性，不与相关环状病毒发生交叉反应。该方法生产VP7抗原具有简便、快捷和高效的特点。本发明利用原核表达载体pBAD/Thio TOPO成功高效表达BTV VP7群特异性抗原，首次创立原核表达蓝舌病病毒群特异性抗原VP7，研制蓝舌病诊断试剂的新策略。
下列所示的为BTV VP7基因重组表达质粒载体中表达VP7融合蛋白的核苷酸序列。
gacactatcg ctgcaagagc acttactgtg atgcgagcat gtgctacgct tcaagaagca agaattgtgttggaagctaa cgtgatggag atactgggga tagcaatcaa cagatataat ggattaactt tacgaggggtgacgatgcgc ccgacctcat tggcgcagag aaatgagatg ttttttatgt gtttagatat gatgctgtccgcggctggga taaacgtagg accgatatct ccagattata cccaacatat ggctacaatt ggtgtactagcgacgccaga gatacctttt acaacggaag cggcgaatga gattgctcgc gtgactgggg agacttcgacgtgggggcca gcccgtcagc cttatggttt cttccttgaa actgaggaaa ccttccagcc cggacgttggttcatgcgtg ccgcccaagc agcaactgcg gtagtgtgtg gtccggatat gattcaagtg tcactgaatgctggagcaag aggagatgtg cagcagatat ttcagggtcg taacgacccc atgatgatat atctagtttggagaagaatt gaaaacttcg cgatggcgca gggtaactca cagcaaactc aagcaggcgt gactgttagcgttggtggag tagatatgcg ggcggggcgt atcatagcgt gggatggaca ggctgctcta catgtgcgcaatccaacaca acagaatgcg atggttcaga tacaggtcgt gttctacatt tctatggata agaccttaaatcaataccct gccttgactg ctgaaatctt taatgtttat agcttcagag atcacacatg gcacgggcttagaacggcta tacgcaacag aactacactg ccgaatatgc tgccacccat ctttccacca aacgatcgagatagtatcct gactcttttg cttttgtcta cgcttgctga tgtttatact gttttaagac ctgagttcgcgatgcacggc gtaaacccaa tgccttggcc gctcacagct gctattgcac gcgccgccta tgtg。
下列所示的为VP7融合蛋白的氨基酸序列。
MGSDKIIHLT DDSFDTDVLK ADGAILVDFW AHWCGPCKMI APILDEIADE YQGKLTVAKL 60NIDHNPGTAP KYGIRGIPTL LLFKNGEVA4 TKVGALSKGQ LKEFLDANLA GSGSGDDDDK 120LALDTIAARA LTVMRACATL QEARIVLEAN VMEILGIAIN RYNGLTLRGV TMRPTSLAQR 180NEMFFMCLDM MLSAAGINVG PISPDYTQHM ATIGVLATPE IPFTTEAANE IARVTGETST 240WGPARQPYGF FLETEETFQP GRWFMRAAQA VTAVVCGPDM IQVSLNGGAR GDVQQIFQGR 300NDPMMIYLVW RRIENFAMAQ GNSQQTQAGV TVSVGGVDMR AGRIIAWDGQ AALHVHNPTQ 360QNAMVQIQVV FYISMDKTLN QYPALTAEIF NVYSFRDHTW HGLRTAILNR TTLPNMLPPI 420FPPNDRDSIL TLLLLSTLAD VYTVLRPEFA IHGVNPMPGP LTRAIARAAY VKGELEGKPI480PNPLLGLDSTRTGHHHHHH.......... .......... .......... .......... 498
权利要求
1.一种蓝舌病病毒VP7基因重组表达质粒载体，其特征在于命名为p BAD-B5重组表达质粒载体，其表达VP7融合蛋白的核苷酸序列为gacactatcg ctgcaagagc acttactgtg atgcgagcat gtgctacgct tcaagaagca agaattgtgt tggaagctaa cgtgatggagatactgggga tagcaatcaa cagatataat ggattaactt tacgaggggt gacgatgcgc ccgacctcat tggcgcagagaaatgagatg ttttttatgt gtttagatat gatgctgtcc gcggctggga taaacgtagg accgatatct ccagattata cccaacatatggctacaatt ggtgtactag cgacgccaga gatacctttt acaacggaag cggcgaatga gattgctcgc gtgactggggagacttcgac gtgggggcca gcccgtcagc cttatggttt cttccttgaa actgaggaaa ccttccagcc cggacgttgg ttcatgcgtgccgcccaagc agcaactgcg gtagtgtgtg gtccggatat gattcaagtg tcactgaatg ctggagcaag aggagatgtgcagcagatat ttcagggtcg taacgacccc atgatgatat atctagtttg gagaagaatt gaaaacttcg cgatggcgca gggtaactcacagcaaactc aagcaggcgt gactgttagc gttggtggag tagatatgcg ggcggggcgt atcatagcgt gggatggacaggctgctcta catgtgcgca atccaacaca acagaatgcg atggttcaga tacaggtcgt gttctacatt tctatggata agaccttaaatcaataccct gccttgactg ctgaaatctt taatgtttat agcttcagag atcacacatg gcacgggctt agaacggcta tacgcaacagaactacactg ccgaatatgc tgccacccat ctttccacca aacgatcgag atagtatcct gactcttttg cttttgtcta cgcttgctgatgtttatact gttttaagac ctgagttcgc gatgcacggc gtaaacccaa tgccttggcc gctcacagct gctattgcac gcgccgcctatgtg。
2.一种蓝舌病病毒VP7基因重组表达质粒载体所表达获得的VP7表达抗原，其特征在于命名为BTV VP7融合蛋白，其氨基酸序列为HP-ThioredoxinMGSDKIIHLT DDSFDTDVLK ADGAILVDFW AHWCGPCKMI APILDEIADE YQGKLTVAKL 60NIDHNPGTAP KYGIRGIPTL LLFKNGEVAA TKVGALSKGQ LKEFLDANLA GSGSGDDDDK 120LALDTIAARA LTVMRACATL QEARIVLEAN VMEILGIAIN RYNGLTLRGV TMRPTSLAQR 180NEMFFMCLDM MLSAAGINVG PISPDYTQHM ATIGVLATPE IPFTTEAANE IARVTGETST 240WGPARQPYGF FLETEETFQP GRWFMRAAQA VTAVVCGPDM IQVSLNGGAR GDVQQIFQGR 300NDPMMIYLVW RRIENFAMAQ GNSQQTQAGV TVSVGGVDMR AGRIIAWDGQ AALHVHNPTQ 360QNAMVQIQVV FYISMDKTLN QYPALTAEIF NVYSFRDHTW HGLRTAILNR TTLPNMLPPI 420FPPNDRDSIL TLLLLSTLAD VYTVLRPEFA IHGVNPMPGP LTRAIARAAY VKGELEGKPI480PNPLLGLDSTRTGHHHHHH.......... .......... .......... ..........498V5 epitope 6His tag。
3.按照权利要求1所述的蓝舌病病毒VP7基因重组表达质粒载体的制备方法，其特征在于由以下步骤组成(一)、将BTV编码群特异性抗原VP7基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中，构建VP7基因克隆重组质粒，进行核苷酸序列分析；(二)、亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体；(三)、转化TOP10细胞，经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定；(四)、筛选获得BTV VP7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆，即构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体。
4.按照权利要求2所述的蓝舌病病毒VP7基因重组载体表达所获得的BTVVP7抗原的制备方法，其特征在于由以下步骤组成(一)、将筛选获得的含有BTV群特异性抗原VP7表达重组质粒阳性克隆载体的工程菌株，接种于含100μg/mL Amp的LB培养基，37℃振荡培养12h；(二)、上述培养物按1％的体积接入含100μg/mL Amp的LB培养基，37℃振荡培养4h；(三)、在培养基中加入阿拉伯糖至最终浓度为0.02％，温度降至30℃，继续振荡培养，缓慢诱导表达5h；(四)、收集菌液以4℃下5000r/min离心30min，将沉淀菌体按1∶10W/V悬浮于TE缓冲液，置冰水浴中300~400W反复超声破菌，每次15s，间隔15s；(五)、菌体裂解液以4℃下5000r/min离心30min，取上清液为粗提的BTVVP7重组融合蛋白；(六)、用ELISA试验测定BTV VP7重组融合蛋白抗原效价。
全文摘要
本发明涉及一种对动物蓝舌病进行检测的生物制剂以及这种生物制剂的制备方法。本制剂包括蓝舌病病毒VP7基因重组表达质粒载体以及由其表达所获得的蓝舌病病毒VP7重组抗原，其制备方法为一、将BTV编码群特异性抗原VP7基因片段克隆至pMD18－T质粒载体中，构建VP7基因克隆重组质粒；二、亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体；三、转化TOP10细胞；四、筛选获得BTV VP7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆，即构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体；五、该重组质粒载体用含100μg/mL Amp的LB培养基进行培养，可稳定、高效表达BTV VP7重组抗原，可作为蓝舌病诊断试剂。
文档编号G01N33/53GK1563383SQ200410008748
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月17日 优先权日2004年3月17日
发明者花群义, 徐自忠, 董俊, 杨晶焰, 杨云庆, 周晓黎, 贾建军, 肖荣海, 龙忠保 申请人:云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心