roE-F和groE-R为引物，PCR扩增布鲁菌 groE基因的启动子区，凝胶回收片段，经化ηI和BamHI双酶切后插入相同酶酶切过的 pTMl-Cm质粒，构建成的重组质粒命名为PGH-6X化S。
[0045] 该质粒可用酶切点有6个，外源基因的开放阅读框（OR巧直接插入至质粒的MCS 区可实现祀基因在布鲁菌中持续高效表达，由于groE-R引物上带有6X化S编码序列，表达 的外源蛋白氨基酸N端带有6X化S标签，可W通过免疫印迹进行鉴定。
[0046] 本发明的诱导型表达质粒PZT-6X化S，具有SEQIDNO. 5所示的核巧酸序列。
[0047] 所述诱导型表达质粒pZT-6XHis，W质粒pG-KJE8 (Takara)为模板，WpTMl-Cm为 骨架质粒，采用如下引物对进行扩增：
[0048] pzt-F:5, -GGGGTACCCCGTTTCCATTTAGGTGGGTAC-3,（沈QIDNO. 22)，
[0049] pzt-R:5^-CGGGATCCGTGATGGTGATGGTGATGCATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATGAATTC-3^ ( 沈QIDNO. 23)。
[0050] 本发明所述pZT-6X化s质粒载体的构建方法，包括如下步骤： 阳化UW质粒PG-UE8为模板，pzt-F和pzt-R为引物，PCR扩增四环素抗性基因（tetR) 和四环素诱导启动子（pztl)区，产物经胶回收，化ηI和BamHI双酶切后，与同样酶双酶 切的pTMl-Cm质粒连接，构建成四环素可诱导型质粒ρΖΤ-6X化S。
[0052] 该质粒可用酶切点有3个，外源基因的0RF直接插入至质粒的MCS区可实现祀基 因的诱导表达，由于pzt-R引物上带有6Χ化S编码序列，表达的外源蛋白氨基酸Ν端带有 6X化S标签，可W通过免疫印迹进行鉴定。 阳化引 本发明构建了Ξ种pTM质粒pTMl-Cm、pTM2-Amp和pTM3-Km，该系列质粒能在布鲁 菌中有效复制，用于基因功能性回补。
[0054] 本发明中构建的pTM系列质粒在外源基因插入的多克隆位点（MC巧区后紧连终止 子序列，使基因互补试验中祀基因的插入和操作变得更为简单。 阳化5] 本发明中WpTMl-Cm质粒为骨架，构建了一个用于布鲁菌持续高效表达外源基因 的载体PGH-6X化S，表达的外源蛋白带有His标签，便于鉴定。
[0056] 本发明中WpTMl-Cm质粒为骨架，构建了一个用于布鲁菌可诱导表达外源基因的 载体PZT-6X化S，该质粒可通过在培养基中添加四环素来诱导外源基因的表达，同时，表达 的外源蛋白带有His标签，便于鉴定。
[0057] 本发明系列质粒具有W下特点：
[00郎]1)质粒小巧，便于操作。
[0059] 2)pTMl-Cm、pTM2-Amp和pTM3-Km可用于布鲁菌缺失基因的功能性回补试验。
[0060] 3)PGH-6X化S用于在布鲁菌中持续高效表达外源基因，且表达蛋白的N末端带有 His标签，便于免疫印迹检测.
[0061] 4)ρΖΤ-6Χ化S带有四环素诱导型表达启动子，可用于在布鲁菌中对外源基因进行 四环素诱导型可控表达。
[0062] 本发明系列质粒的使用将为布鲁菌基因功能研究提供重要工具。
【附图说明】
[0063] 图1为本发明pTMl-Cm载体的构建方案。 W64] 其中，PCR分别扩增地BR1-MCS质粒的复制位点（rep)序列，PR326质粒的Cm抗性 基因片段，pCold质粒的MCS序列和冷休克蛋白A(cspA)的终止子序列。一轮融合PCR融 合Cm和MCS-终止子序列，二轮融合PCR将r巧序列与Cm-MCS-终止子序列融合在一起，经 NdeI酶切连接成环，构建成pTMl-Cm质粒。
[00化]图2为本发明pTM系列载体骨架图。
[0066] 其中，克隆质粒pTMl-Cm、pTM2-Amp、pTM3-Km、表达质粒pGH-6XHis和可诱导表达 质粒PZT-6X化S的骨架图，W及该系列质粒可用的限制性酶切位点。
[0067] 图3为本发明PGH-6X化S高效表达外源基因。
[0068] 其中，免疫印迹验证绿色巧光蛋白巧GF巧和红色巧光蛋白值sRed)在S2308中的 表达（A) ;EGFP和DsRed表达使生长的菌落呈现明显的绿色巧光和红色巧光度）；EGFP和 DsRed在布鲁菌感染巨隧细胞中持续表达，细胞中增殖的细菌呈现明显的绿色或红色巧光 似。
[0069] 图4为本发明PZT-6X化S在布鲁菌中诱导表达外源基因。
[0070] 其中，（A)免疫印迹试验显示，外源四环素添加至50和10化g/mL时，EGFP在布鲁 菌中成功诱导表达；度）巧光观察显示，5化gAiL四环素成功诱导细菌表达EGFP，呈现绿色 巧光；似感染细胞试验显示，在同一细胞中，布鲁菌在添加四环素（lOOng/血）时成功诱导 表达EGFP，呈现绿色巧光，与抗体染色的红色细菌呈现共定位。当培养基中未添加四环素 时，抗体着染的红色布鲁菌未呈现绿色巧光。
【具体实施方式】
[0071]W下结合具体实施例，进一步阐述本发明。运些实施例仅用于说明本发明而不用 于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按 照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所熟悉的意义相同。
[0072] 本发明中未标注的试剂和原料均为市场上购买所得。 阳073] 本发明中构建的5种质粒的序列详见序列表。 W74] 实施例1 阳0巧]本实施例用于研究pTM系列载体的构建
[0076] 1. 1pTMl-Cm质粒构建
[0077]pTMl-Cm的构建如图1所示，W地BR1-MCS质粒为模板，WTM01和TM02为引物， PCR扩增质粒的r巧序列；WPR326质粒为模板，TM03和TM04为引物，PCR扩增Cm抗性基因 片段；WpCold质粒为模板，TM05和TM06为引物，PCR扩增质粒的MCS-终止子序列。胶回 收W上PCR产物片段。然后，WCm片段和MCS-终止子片段为模板，采用引物TM03和TM06 为引物，进行一轮融合PCR反应，所得片段胶回收后，与PCR扩增获得rep序列共同作为模 板，WTM01和TM06为引物，进行第二轮融合PCR，所得片段胶回收后，经限制性酶NdeI酶 切和T4DNA连接酶进行自连接成环，构建成pTMl-Cm质粒（核巧酸序列如SEQIDNO. 1所 示），质粒转化至大肠杆菌D册α进行扩增。
[0078] 1. 2pTM2-Amp质粒构建
[0079] 构建方法同pTMl-Cm构建方法，W地BR1-MCS质粒为模板，TM01和TM07为引物， PCR扩增rep区序列，WPUC19质粒为模板，TM08和TM09为引物，PCR扩增Amp抗性基因， WpCold质粒为模板，TM10和TM06为引物，PCR扩增MCS-终止子区序列。抗性基因片段 和MCS-终止子区序列为模板，TM08和TM06为引物，进行一轮PCR，胶回收一轮融合片段，与 PCR扩增获得rep序列共同作为模板，TM01和TM06为引物，进行二轮融合PCR反应，将二轮 融合PCR产物胶回收，NdeI酶切后，T4连接酶自连接，构建成pTM2-Amp质粒（核巧酸序列 如沈QIDNO. 2所示）。
[0080] 1. 3pTM3-Km质粒构建
[0081] 构建方法同pTMl-Cm构建方法，W地BR1-MCS质粒为模板，TM01和TM11为引物， PCR扩增rep区序列，W祀T28a质粒为模板，TM12和TM13为引物，PCR扩增Km抗性基因，WpCold质粒为模板，TM14和TM06为引物，PCR扩增MCS-终止子区序列。抗性基因片段 和MCS-终止子区序列为模板，TM12和TM06为引物，进行一轮PCR，胶回收一轮融合片段，与 PCR扩增获得rep序列共同作为模板，TM01和TM06为引物，进行二轮融合PCR反应，将二轮 融合PCR产物胶回收，NdeI酶切后，T4连接酶自连，构建成pTM3-Km质粒（核巧酸序列如 沈QIDNO. 3所示）。
[0082] 1.4P細-6XHis载体的构建
[0083] W流产布鲁菌S2308基因组为模板，groE-F和groE-R为引物，PCR扩增布鲁菌 groE基因的启动子区，凝胶回收片段，经化ηI和BamHI双酶切后插入相同酶酶切过的 pTMl-Cm质粒，构建成的重组质粒命名为pGH-6X化S，其结构图谱详见图2B，该质粒可用酶 切点有6个，外源基因的开放阅读框（OR巧直接插入至质粒的MCS区可实现祀基因在布鲁 菌中持续高效表达，由于groE-R引物上带有6X化S编码序列，表达的外源蛋白氨基酸N端 带有6X化S标签，可W通过免疫印迹进行鉴定，核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0084] 1. 5pZT-6XHis载体的构建
[0085] W质粒PG-UE8为模板，pzt-F和pzt-R为引物，PCR扩增四环素抗性基因（tetR) 和四环素诱导启动子（pztl)区，产物经胶回收，化ηI和BamHI双酶切后，与同样酶双酶切 的pTMl-Cm质粒连接，构建成四环素可诱导型质粒PZT-6X化S，其结构图谱详见图2C，该质 粒可用酶切点有3个，外源基因的0RF直接插入至质粒的MCS区可实现祀基因的诱导表达， 由于pzt-R引物上带有6X化S编码序列，表达的外源蛋白氨基酸N端带有6X化S标签，可 W通过免疫印迹进行鉴定，核巧酸序列如SEQIDNO. 5所示。
[0086] 1. 6构建质粒时所用引物序列如下：
阳105]其中，TM02 与TM03、TM04 与TM05、TM07 与TM08、TM09 与TM10、TM11 与TM12、TM13 与TM14为融合引物，其分别设计为反向互补序列。1. 7PCR反应体系W及反应条件
[0106]PCR反应使用的酶为宝生物公司maxDNA聚合酶，反应末端为平末端，反应体系 为50μ^各组分分别为：模板2yL(融合PCR时，模板各加Ιμ?;上下游引物（ΙΟμΜ)各 为2μL;PrimerSTARMaxPremix为25μL;最后加水补足50μL体系。PCR反应程序为试 剂盒推荐程序，反应条件为：98°C预变性2min，98°C变性10sec，55°C退火15sec，72°C延伸 30s