体内快速分析rna功能元件的系统及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，尤其设及一种体内快速分析RNA功能元件的系 统。
【背景技术】
[0002] 真核生物mRNA的3'UTR(3'Un-TranslatedRegion)上有多种调控元件，可W 特异的招赛各种miRNA及RNA结合蛋白，从而能够调巧mRNA的降解、翻译和亚细胞定位 (Qiatterjeeetal.,BiologyoftheCell, 2009;MayrandBartel,Cell, 2009;Szostak andGebauer. ,briefingsinF^mctionalGenomics, 2012)。真核生物mRNA的 3,UTR- 般都是长长的序列，而那些有功能的调控元件就隐藏在其中，目前，科学研究中仍然缺少高 效、便捷分析mRNA3'UTR中的功能性元件的系统。
[0003] 有研究者在人类细胞中转入一种载体，利用双向启动子分别启动GFP和mCherry 的基因转录，其中GFP作为内参，mCher巧终止密码子之后与不同序列的3'UTR分别融合而 形成报告基因；然后，通过流式细胞仪和高通量测序检测各种短的非编码RNA对报告基因 RNA稳定性或翻译的影响（(Mkonomouetal.，CellR巧ort，2014)。另外，也有研究者构建 了类似的载体，并通过细胞流式分类（flow巧tometricscxrting)鉴定了一系列影响RNA 翻译或稳定性的顺式作用元件狂haoetal.,化1:ureBiotechnology, 2014)。
[0004] 目前并没有在植物体内快速寻找mRNA3'UTR中有功能的顺式作用元件的方 法。其次，运些顺式作用元件通常是需要响应外源药物处理、内源信号通路或效应蛋白 (effectorprotein)来完成对mRNA的调控。已报道的系统均通过大规模的筛选、分析、鉴 定RNA顺式作用元件RNA序列，但并未提及能否检测内外源信号或效应蛋白对运些元件的 调控作用。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种体内快速分析RNA功能元件的系统，解决现有技术中无法 在植物体内快速寻找mRNA3'UTR中有功能的顺式作用元件，W及检测内、外源信号及效应 蛋白对顺式作用元件的调控作用的问题。
[0006]本发明解决技术问题采用如下技术方案：一种体内快速分析RNA功能元件的系 统，包括双巧光报告载体p35mG，所述载体包括编码SEQIDNo. 1的序列。
[0007] 优选地，所述双巧光报告载体p35mG是由下述步骤制得：将PCAMBIA2335载体的 抗性基因ΝΡΤΠ用限制性内切酶化〇1切掉，连入mCher巧巧光蛋白基因；在多克隆位点中 化nl和甜al两个酶切位点间连入GFP巧光蛋白基因，所述mCherry巧光蛋白和所述GFP巧 光蛋白分别由同一个载体上的两个不同的35S启动子驱动。
[0008] 优选地，所述双巧光报告载体p35mG中连入待测基因片段后构建成重组报告基因 在植物体中瞬时表达。
[0009] 优选地，还包括效应蛋白载体，所述效应蛋白载体与重组报告基因在植物体内共 表达。
[0010] 优选地，所述效应蛋白载体为效应蛋白连入任一植物表达载体。
[0011] 优选地，所述重组报告基因和所述效应蛋白载体由农杆菌介导在烟草叶片中瞬时 表达。
[0012] 优选地，由所述重组报告基因中GFP和mCherry在植物体内表达的巧光强度的比 值鉴定待测基因片段。
[0013] 一种体内快速分析RNA功能元件的方法，包括如下步骤：
[0014] (1)构建双巧光报告载体p35mG，所述载体包括编码SEQIDNo. 1的序列；
[001引 似在所述双巧光报告载体p35mG中连入待测基因片段，构建得到重组报告基因；
[0016] (3)将所述重组报告基因瞬时表达在植物体中；
[0017] (4)分析所述重组报告基因中GFP和mCherry在植物体内表达的巧光强度，并计算 两者巧光强度的比值，鉴定待测基因片段。
[0018] 优选地，所述方法还包括构建效应蛋白载体，将效应蛋白连入植物表达载体后，与 重组报告基因在植物体中共表达。
[0019] 一种体内快速分析RNA功能元件的系统的应用，检测内外源信号或效应蛋白对体 内RNA功能元件的调控作用。
[0020] 本发明通过构建包括编码SEQIDNo. 1序列的双巧光报告载体p35mG，其中包括一 个巧光蛋白mCherry作为内参，一个巧光蛋白GFP作为报告基因，连入待测基因片段后构建 成重组报告基因，通过分析不同片段对GFP与mCherry巧光强度比值的影响，快速鉴定待测 基因片段RNA中的顺式作用元件；并且可W通过施加不同处理或表达不同的效应蛋白来控 制顺式作用元件调控的过程，W此研究植物体内效应蛋白对RNA的调控作用。
【附图说明】
[0021] 图 1 为PCAMBIA2335 载体图；
[002引图2为本发明快速分析体内RNA功能元件的系统的p35mG图；
[0023]图3为本发明快速分析体内RNA功能元件的系统的流程示意图；
[0024] 图4为本发明快速分析体内RNA功能元件的系统检测乙締信号介导的3'UTR对 GFP蛋白翻译的抑制效应的示意图；
[0025] 图5为本发明快速分析体内RNA功能元件的系统检测RNA功能元件响应ACC并介 导翻译抑制过程的示意图；
[0026] 图6为本发明快速分析体内RNA功能元件的系统鉴定响应乙締信号并介导翻译抑 制的片段的结果示意图；
[0027] 图7为本发明快速分析体内RNA功能元件的系统检测效应蛋白对RNA翻译抑制作 用的结果示意图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步阐述。W下实施例中使用的 试剂和材料均为市售商品。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例提供了一种快速分析体内RNA功能元件的系统，对图1所示的 PCAMBIA2335载体进行改造，将其抗性基因ΝΡΤΠ用限制性内切酶化〇1切掉，连入mCherry 巧光蛋白基因；在多克隆位点中化nl和Xbal两个酶切位点间连入GFP巧光蛋白基因，运样 两个巧光蛋白分别由同一个载体上的两个不同的35S强启动子驱动，就构成了一个双巧光 报告载体，命名为pCAMBIA2335mG，简称p35mG，如图2所示。
[0031] 具体构建载体的方法如下：
[0032] 1.引物
[0033]扩增mCher巧：
[0034] 正向引物
[0035]tctctcg曰gctttcgc曰g曰tctgtcg曰teg曰CC曰tggtg曰gc曰曰gggcg曰gg曰gg曰t曰曰C曰tggcc曰tc 过tc过过gg过gttc
[0036] 弓I坪勿agcctcgagtcacttgtacagctcgtccatgccgccggtggag
[0037]扩增GFP:
[0038]正向引物gtcggtaccatggtgagcaagggcga邑
[0039] 反向引物ttatctagatccggtggatccaagcttc
[0040] 2.PCR体系
[0041]
[0042]PCR程序：94°C 2min
[0043] 94°C15s，58°C 30s，68°Clmin，35 个循环
[0044] 68°C lOmin
[0045] 10°ClOmin反应结束
[0046] 切胶回收：A巧gen试剂盒
[0047] 3.酶切
[0048]
[004引酶切条件：37°C，2-3小时[0050]酶切产物回收：Axygen试剂盒 [005U 4.连接：
[0052]
[0053] 连接条件：肥B的T4连接酶，室溫（22°C-25°C) 2-3小时
[0054] 5.转化涂板
[0055] 将连接产物全部加入50μΙ感受态中，42°C热激1分钟后加入600uLLB，37度 220巧m摇菌40min，涂板。
[005引6.提质粒，采用Axygen试剂盒。
[0057] 7.克隆鉴定
[0058]
[0059] 能切下大小正确的片段的质粒送测序，保存测序正确的质粒。
[0060] 本实施例中，将p35mG中的mCherry作为内参，GFP后面连入需要鉴定功能的 3'UTR片段生成新的重组报告基因GFP-3'UTR，该重组子的构建方法与上述构建p35mG载 体的方法类似，具体引物序列依不同目的基因片段而设计不同序列，如图3A所示，即为重 组报告基因；效应蛋白连入另一个载体中，如图3B所示，即为效应蛋白载体；如图3C所示， 将构建的重组报告基因和效应蛋白载体由农杆菌介导瞬时表达在烟草叶片中，有图3D所 示，重组报告基因中的GFP和mCherry两种巧光蛋白同时表达；如图3E所示，根据ZEN软件 分析给出的GFP和mCher巧巧光强度，计算GFP与mCher巧巧光强度的比值，即可衡量不同 3'UTR片段W及效应蛋白对GFP报告基因翻译的影响。
[0061] 农杆菌侵染烟草及巧光观察实验方法如下：
[0062] 选择生长一个月左右的烟草。从-80°C冰箱中取出保存的菌液，涂在含有抗生素的 LB培养皿上，3(TC培养过夜。挑取在板上生长的菌落，接入含有抗生素的LB液体培养基 中，30°C，220rpm摇菌过夜，至菌液为橘黄色。按1:500将过夜培养的菌液接入15mL含有抗 生素的LB液体培养基中，30°C，220巧m摇菌过夜，至ODe。。约为1. 5。4000巧m，4°C离屯、15min 收集菌体，用15mL烟草叶片侵染缓冲液重悬。400化pm，4°C离屯、15min收集菌体，用lOmL烟 草叶片侵染缓冲液重悬。再次4000rpm，4°C离屯、15min收集菌体，用lOmL烟草叶片侵染缓 冲液重悬。测重悬后菌体的浓度，将ODe。。调至0. 5 (若同时注射两种菌，将0De。。调至0. 6。 将两种菌液按1:1的体积比混合），用ImL注射器将菌液注入烟草叶片的下表皮，打满整片 叶子。22°C培养2-3天后即可观察巧光。取要观察的烟草叶片置于载玻片上，加50-lOOuL 蒸馈水并加盖盖玻片，置于显微镜载物台，本发明所用激发波长为：GFP巧10nM-543nM)、 mCherry巧61nM-633nM)，然后进行巧光观察和拍照。蔡司的ZEN软件可W自动分析不同通 道的巧光强度。
[0063] 将p35mG空载体瞬时表达在烟草叶片中，使用低倍物镜（如5讶观察烟草叶片并 拍照记录GFP和mCher巧的巧光。非同一棵烟草、非同一片叶片W及同一叶片的不同位置， 巧光表达强度可能都不一致，需要选取不同烟草不同叶片的不同位置分别拍照并检测巧光 强度计算GFP与mCherry的巧光强度比值，具体数据结果见下表1 :
[0064] 表1重组报告基因中GFP与mCherry在烟草叶片中表达的巧光强度
[0065]
[0066]
[0067] 从W上结果可W看出，不同的烟草叶片W及不同视野中的巧光强度都不一致，但 是每个视野中GFP巧光增强时，mCherry巧光也会相应增强，反之亦然，即GFP与mCherry的 比值基本一致。所W如果在GFP的编码区之后接上一段3'UTR序列，能够导致比值变化， 则说明运段序列影响了GFP巧光蛋白的表达。通过施加不同处理或表达效应蛋白来检测带 有RNA功能元件的GFP与mChe