rry巧光强度比值是否变化，也可W判断不同处理或效应蛋 白对RNA功能片段的调控作用。
[0068] 对本实施例快速分析体内RNA功能元件的系统的检测：
[0069] (1)烟草RNA功能元件分析系统中邸FlmRNA全长3'UTR能够响应ACC介导翻译 抑制
[0070] 中国专利化2011 1 0110101.0中已经公开乙締信号通路中邸F1,邸F2基因mRNA 的3'UTR具有翻译抑制功能，因此通过本实施例快速分析体内RNA功能元件的系统鉴定其 中行使功能的顺式作用元件，进而检测本实施例快速分析体内RNA功能元件的系统是否可 用。
[007。 如图4A和4B所示，"Air"组为空白对照组Z'ACC"组为加入ACC的实验组；制备重 组报告基因，即将全长的邸F1mRNA3'UTR(1U' 0)连入双巧光报告载体p35mG中GFP基因 之后，接着，分别检测双巧光报告载体p35mG和重组报告基因对乙締合成前体ACC的响应， 如图4A所示，双巧光报告载体p35mG组是否施加ACC，其巧光强度无明显变化，带有邸F1 mRNA全长3'UTR的重组报告基因组施加ACC后GFP巧光强度明显减弱。
[0072] 具体实验方法同上所述农杆菌侵染烟草及巧光观察实验方法，ACC处理浓度为 100μM，随菌液一起打入烟草叶片中，在观察巧光前6-8小时再打一次。
[0073] 图4Α具体实验数据及比值见下表2和表3(柱状图中每一个柱是至少10个视野 中GFP与mCherry巧光强度比值平均值标准化的结果）：
[0074] 表2空气中和施加ACC后，双巧光报告载体p35mG中GFP与mCherry在烟草叶片 中表达的巧光强度
[00巧]
[0076]
[0077] 表3空气中和施加ACC后，重组报告基因中GFP与mCherry在烟草叶片中表达的 巧光强度
[0078]
[0079]
[0080] 从W上结果可W看出，无论是否有ACC处理，双巧光报告载体p35mG中GFP与 mCherry巧光强度的比值基本不变，而带有邸F1 3'UTR的GFP(IU'O)的重组报告基因则比 值显著降低，即比值从1. 49降到了0. 61。
[00引]如图4B所示，为双巧光报告载体p35mG和重组报告基因对乙締合成前体ACC的转 录本水平检测。其中，烟草叶片RNA的提取采用QIAGEN试剂盒（QIAGENRNeasyPlantMini Kit);反转录采用Takara反转录试剂盒（PrimeScriptΓ*StandcDNASynthesisKit); RealtimePCR体系及程序见TakaraSYBRPremixExTaq说明书，结果义用罗氏Li曲t-480 的Real-timePCR仪器计算生成。结果显示，加了ACC之后35mG和lU' 0的转录本水平不 变，所W运个系统可W检测乙締信号介导的3'UTR对GFP蛋白翻译的抑制效应。
[008引似1U' 1，1U' 2和1U' 4能够响应乙締并抑制报告基因的翻译[0083] 如图5A所示，根据长度，将邸FlmRNA的3' UTR分为5段，分别构建到双巧光报告 载体p35mG中，用本实施例体内快速分析RNA功能元件系统检测每一段的功能。如图5B所 示，其中a和b分别为空气中和施加ACC后GFP与mCherry巧光强度比值标准化后的结果， C为b与a的比值，表示ACC对翻译的抑制强度（值越低说明抑制作用越强）。从结果中可W看出第1段（1U' 1)、第2段（1U' 2)和第4段（1U' 4)能够响应ACC并介导翻译抑制过 程（C，即b与a的比值低于1)，但是抑制强度都不及全长（1U)。
[0084]图5B实验结果的具体数据见下表4 :
[00财表4空气中和施加ACC后，各表达载体中GFP与mCherry在烟草叶片中表达的巧 光强度
[0086]
[0087] 实施例2
[0088] 本实施例提供一种体内快速分析RNA功能元件的系统，能够准确鉴定到响应乙締 信号并介导翻译抑制的片段。
[0089] 经典的乙締反应就是人们所熟知的Ξ重反应，具体表现为当施加乙締时黄化苗呈 现出下胚轴变短、变粗，根变短，顶端弯钩加剧。之前的研究发现过表达邸F1全长3'UTR转 基因植株（G1U)在含有10μΜACC(-种乙締生物合成的前体）的培养基上生长3天的黄 化苗，有明显的乙締不敏感表型，其下胚轴长度，根长度均明显长于野生型，并且顶端弯钩 消失，中国专利号化20111 0110101.0中已公开。
[0090] 同样，当我们将上述经本发明检测系统证明有翻译抑制功能的片段在拟南芥中过 表达时，如图6Α，为在含有10μΜACC的MS板上暗中培养3天的黄化化发现与全长3'UTR 几乎一致，也能看到乙締不敏感表型，但与全长3'UTR过表达植株相比表型略弱一些。如图 6B所示，其中C为ACC对GFP巧光蛋白的翻译抑制强度，由统计结果可知，乙締不敏感表型 也与全长3'UTR过表达相似。
[0091] 图6B具体实验数据见下表5 :
[009引表5空气中和施加ACC后，各表达载体中GFP与mCher巧在拟南芥中表达的巧光 强度
[0093]
[0094] 实施例3
[0095] 本实施例提供一种体内快速分析RNA功能元件的系统，能够检测效应蛋白对RNA 翻译的抑制作用。
[0096] 本实施例提供的体内快速分析RNA功能元件的系统，能够检测到响应乙締信号并 介导翻译抑制的片段，得出的结论与3'UTR片段过表达在拟南芥中的表型相符。所W运个 系统可W广泛用于植物体内快速分析RNA功能元件，并且可W检测不同信号对3'UTR的调 控作用。
[0097] 在本实施例烟草瞬时表达系统中，可W同时转入多个含有不同质粒的农杆 菌，所W运个系统还可W用来研究效应蛋白对RNA的调控作用。已知EIN5巧t的lele Insensitive5，Potuschaketal.,PlantCell, 2006 ;01medoetal.,PNAS, 2006)作为 P-body(Processingbody,是多种蛋白和RNA构成的复合体，参与mRNA降解、翻译抑制等 重要过程，Newburyetal. ,EMB0r巧orts, 2006)的组分，同时EIN5还具有抑制邸F1/2功 能的作用（Potuschaketal.，PlantCell，2006;01medoetal.，PNAS, 2006)，所W在运个 系统中，本实施例同时转入图3B所示的效应蛋白载体和报告基因载体，其中效应蛋白载体 包括EIN5组和Vector组，所述Vector组为未连入效应蛋白的空载体，所述报告基因载体 包括双巧光报告载体p35mG和图3A所示的重组报告基因（lU'O);如图7所示，可W看到 双巧光报告载体p35mG的GFP相对巧光强度不受效应蛋白EIN5调控，表达效应蛋白空载 体（vector)对带有邸F13'UTR的GFP(IU'O)的巧光强度也没有影响，而效应蛋白EIN5对 1U' 0有显著的翻译抑制作用，如表6所示，相对巧光强度从1. 8左右降到0. 85。具体实验 步骤与上述打烟草基本相同，区别是同时转入两种农杆菌，分别带有重组报告基因和效应 蛋白载体，调整两种菌液的ODe。。均为0. 3,即菌液总0D为0. 6,用ImL注射器（不带针头） 打满烟草叶片。2-3天后即可进行巧光观察拍照。具体实验数据见下表6。
[009引综上结果可知，本发明快速分析RNA功能元件的系统可W用来在植物体内研究效 应蛋白对RNA功能片段的调控作用。
[0099] 表6效应蛋白（EIN5组和Vector组）与报告基因载体（p35mG组和lU'O组）在 植物体内共表达时GFP的巧光强度
[0100]
[0101]W上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。
[0102] 最后应说明的是：W上实施例仅用W说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽 管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然 可W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替 换；而运些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精 神和范围。
【主权项】
1. 一种体内快速分析RNA功能元件的系统，其特征在于，包括双荧光报告载体p35mG， 所述载体包括编码SEQIDNo. 1的序列。2. 根据权利要求1所述的体内快速分析RNA功能元件的系统，其特征在于，所述双荧光 报告载体p35mG是由下述步骤制得：将pCAMBIA2335载体的抗性基因NPTII用限制性内切 酶Xhol切掉，连入mCherry荧光蛋白基因；在多克隆位点中ΚρηΙ和Xbal两个酶切位点间 连入GFP荧光蛋白基因，所述mCherry荧光蛋白和所述GFP荧光蛋白分别由同一个载体上 的两个不同的35S启动子驱动。3. 根据权利要求1所述的体内快速分析RNA功能元件的系统，其特征在于，所述双荧光 报告载体p35mG中连入待测基因片段后构建成重组报告基因在植物体中瞬时表达。4. 根据权利要求3所述的体内快速分析RNA功能元件的系统，其特征在于，还包括效应 蛋白载体，所述效应蛋白载体与重组报告基因在植物体内共表达。5. 根据权利要求4所述的体内快速分析RNA功能元件的系统，其特征在于，所述效应蛋 白载体为效应蛋白连入任一植物表达载体。6. 根据权利要求3-5任一所述的体内快速分析RNA功能元件的系统，其特征在于，所述 重组报告基因和所述效应蛋白载体由农杆菌介导在烟草叶片中瞬时表达。7. 根据权利要求3-5任一所述的体内快速分析RNA功能元件的系统，其特征在于，由所 述重组报告基因中GFP和mCherry在植物体内表达的荧光强度的比值鉴定待测基因片段。8. -种体内快速分析RNA功能元件的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 构建双荧光报告载体p35mG，所述载体包括编码SEQIDNo. 1的序列； (2) 在所述双荧光报告载体p35mG中连入待测基因片段，构建得到重组报告基因； (3) 将所述重组报告基因瞬时表达在植物体中； (4) 分析所述重组报告基因中GFP和mCherry在植物体内表达的荧光强度，并计算两者 荧光强度的比值，鉴定待测基因片段。9. 根据权利要求8所述的体内快速分析RNA功能元件的方法，其特征在于，还包括构建 效应蛋白载体，将效应蛋白连入植物表达载体后，与重组报告基因在植物体中共表达。10. -种体内快速分析RNA功能元件的系统的应用，其特征在于，检测内外源信号或效 应蛋白对体内RNA功能元件的调控作用。
【专利摘要】本发明公开了一种体内快速分析RNA功能元件的系统，包括双荧光报告载体p35mG，所述载体包括编码SEQ？ID？No.1的序列。通过构建包括编码SEQ？ID？No.1序列的双荧光报告载体p35mG，其中一个荧光蛋白mCherry作为内参，另一个荧光蛋白GFP作为报告基因，待测基因片段插入GFP编码序列之后形成重组报告基因GFP-3’UTR，通过分析不同片段对GFP与mCherry荧光强度比值的影响，快速鉴定RNA中有功能的顺式作用元件；此外，还可以通过施加不同处理或表达不同的效应蛋白来控制顺式作用元件调控的过程，以此研究植物体内不同信号或效应蛋白对RNA的调控作用。
【IPC分类】C12N15/63, C12Q1/68
【公开号】CN105255928
【申请号】CN201510683584
【发明人】郭红卫, 马梦迪
【申请人】北京大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月20日