抗菌肽cc34在枯草芽孢杆菌中的表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物领域，具体设及抗菌肤CC34在枯草芽抱杆菌中的表达方法。
【背景技术】
[0002] 抗菌肤是动、植物和人类先天性免疫机制的组成部分，在机体受到病毒、细菌等攻 击时被诱导产生。抗菌肤具有广谱抗菌作用，尤其是对一些产生抗生素耐药性的病原菌的 杀灭作用更引起了人们对它的兴趣。抗菌肤在农业、医疗、食品等领域的应用潜力巨大。迄 今为止，已经发现了上千种天然抗菌肤，但是具有较好的医疗选择指数的种类却比较少，因 此，人们希望通过分子上的重新设计，例如，杂合肤的设计等方式从丰富的天然抗菌肤资源 中获得理想的新型人工抗菌肤。
[0003] 杂合抗菌肤的设计特点是集两个（或W上）天然肤的优点于一身，经过适当的 人工修饰后，可W扬长避短，最大程度上发挥抗菌活性，并不引起溶血。天蚕素抗菌肤 (cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肤；家蛹天蚕素抗菌肤（CecMd)是 本实验室经诱导家蛹幼虫，然后克隆得到的（同源性81% )。而化ensirin是近年来发现 的中国东北林蛙皮肤上分泌的天然抗菌肤，其活性很高，但具有较高的溶血活性。通过对两 者进行杂合设计，获得了低溶血，高抗菌活性的新型杂合抗菌肤CC34,与天然肤相比具有很 大的优势。本研究团队已将抗菌肤CC34在大肠杆菌、毕赤酵母表达体系成功表达，尚未开 展在其他菌种表达体系方面的研究，为此，我们将抗菌肤CC34在枯草芽抱杆菌表达体系进 行表达研究。
[0004] 枯草芽抱杆菌度.Subtilis)作为外源基因的表达宿主，具有如下优点：（1) B.Subtilis是好氧菌不含热源脂多糖（lipopolysaccharides，LPSs)，有益菌无致病性； B.Subtilis被美国FDA认可为安全性菌株。（2)B.Subtilis细胞膜为单层，而大肠杆菌的为 双层，分泌的蛋白在B.Subtilis体系下比在大肠杆菌体系下更容易回收、纯化，操作简便， 许多酶都是B.Subtilis产生的分泌到胞外的蛋白。（3)长期的研究表明，B.Subtilis没有 明显的密码子偏爱性。（4)B.Subtilis对培养基的要求比较简单，在生产中绝对占有经济 优势，隧菌体、质粒都可作为克隆载体，B.Subtilis有良好的转录翻译系统，可W避免形成 错误折叠的蛋白质、包涵体。（5)B.Subtilis的单基因、芽抱的形成等都受多基因调控；16S rRNA3'端的序列也有别于大肠杆菌。
【发明内容】
阳0化]为解决上述问题，本发明提供了一种分离纯化简单、蛋白纯度高、适于大规模工业 化生产的抗菌肤CC34在枯草芽抱杆菌中的表达方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0007] 抗菌肤CC34在枯草芽抱杆菌中的表达方法，包括如下步骤：
[0008] S1、抗菌肤基因的合成及克隆载体的构建
[0009] S11、设计如下两对四条引物，每对都具有互补序列 阳ο…]FI:5f-GCTCTAGAGGTTGGCTGAAAAAAATCGGCAAGAAGATTGA-3,
[0011]R1:5f-ACGGGTATGTTGGCCAACACGTTCAATCTTCTTGCCGATTTTTTTC-3'
[0012] F2 :5f-GGCCAACATACCCGTGATGCCATCCTGCCGATTCTGAGCCTGATTGGTGGTCTG-3'
[0013]R2:5'-TCCCCCGGGTTATTTACCCAGCAGACCACCAATCAGGCTCAGAATC-3'
[0014]S12、将引物FI与Rl、F2与R2在如下的PCR反应体系中分别进行延伸，得到延伸 液P1、P2。具体步骤如下（WP1的PCR反应体系为例）：提前开起PCR仪预热，将2X化q MasterMix25μL、上游引物F1 (10μΜ) 2μL、下游引物R1 (10μΜ) 2μL、RNase-Freewater 21μL加入到PCR反应管中，混合均匀，瞬时离屯、后，置于PCR仪中。反应条件为：94°C预变 性2min;30个循环；72°C终延伸2min，得延伸液P1。同理，可获得延伸液P2 ;
[0015]S13、W第一次PCR得到的延伸液P1与P2相互作为彼此的模板和引物进行PCR， 具体步骤如下：提前开起PCR仪预热，将2XTaqMasterMix25yL、Pl0. 5yL、P2 0. 5yL、 RNase-Freewater24μL加入到PCR反应管中，混合均匀，瞬时离屯、后，置于PCR仪中，反应 条件为：94°C预变性2min;30个循环；72°C终延伸5min，得抗菌肤基因；
[0016] S14、将所得的抗菌肤基因与克隆载体PMD18-T载体连接，在0. 2mL微量离屯、管中， 加入PMD18-TVectorlμレ胶回收后的抗菌肤基因2 (1地2〇 2Solution1 (冰上 融化）5μ^全量为lOyL;混合均匀，瞬时离屯、后，置于连接仪中，4°C，1化，得pMD18-T/CC：M; 阳017] S15、将含有表达载体PHT43的大肠杆菌接种到3mL含有10μg/mLCm的LB培养 基中，37°C20化pm振荡过夜培养，提取质粒，将其与-20°C保存的鉴别正确的克隆质粒分 别进行双酶切，酶切体系如下：甜allyLSaml1μ^质粒DNAlOyL^tSmartBuffer 2yL、灭菌的双蒸水6yL;酶切反应条件为：37°C水浴，3h，其中质粒DM分别为：pHT43、 pMD-18T/CC：M质粒；
[0018] S16、取上述试剂于PCR反应管中，混匀后瞬时离屯、，使溶液聚集在试管底部，37°C 水浴化后，酶切反应完全；
[0019] S17、将酶切好的CC34基因片段和酶切后的质粒PHT43进行连接，即可构建成质粒 载体PHT43/CC34,连接反应体系如下：CC34基因eyLlOXTADNAligaseBufferlμレ质 粒pHT43 2. 5μ^Τ4DMligase0. 5yL;连接反应条件为：16°C水浴，过夜；
[0020]S2、重组表达载体PHT43/CC34转化到宿主细胞中，构建Ξ种表达工程菌菌株；
[0021] S3、将步骤S2得到的表达工程菌WIPTG为诱导剂表达，获得表达产物；
[0022]S4、分离纯化步骤S3所得的表达产物，获得抗菌肤蛋白CC34,并检测其正确性。
[0023] 其中，所述步骤S2中的宿主细胞为枯草芽抱杆菌WB800N。
[0024] 其中，所述步骤S3中所述表达产物为离屯、上清液。
[0025] 其中，所述步骤S4中所述分离纯化采用高效液相色谱法OPLC)纯化，利用质谱法 (M巧检测其正确性。
[00%] 上述分离纯化鉴定正确的抗菌肤CC34,在制备治疗革兰氏阴和/或革兰氏阳性菌 疾病药物、动物饲料添加剂中的应用。
[0027] 其中，所述步骤S12和步骤S13中的30个循环为94°C变性30S，66 °C退火30S，72°C 延伸30s。 阳02引本发明选择PHT43作为表达载体，PHT43载体中插入了一个多克隆位点度amHI， 甜aI，AatII，SmaI)和高效SD序列，所选择的酶切位点是甜al和Smal。而宿主菌又有多 种，但是天然的B.Subtilis在胞外分泌过程中会分泌一些胞外蛋白酶，可能会改变目的蛋 白的基本性能，所W出现了很多敲除可W分泌胞外酶基因的B.Subtilis，如WB600、WB700、 WB800N等，本发明选择敲除了 8个基因的WB800N为宿主菌。
[0029] 本发明具有W下有益效果：
[0030] 本发明应用基因工程技术在枯草芽抱杆菌中高效表达了抗菌肤CC34,经实验证 实种抗菌肤对多种细菌有杀菌作用，表达产物稳定性较好，分离纯化简单，易操作，易放大， 适于大规模工业化生产，对研制新型高效的CC34抗菌饲料添加剂、抗菌药物等具有重要价 值。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明实施例中第一次PCR产物电泳图。其中，1为DNA标准分子量；4 :P2 片段75bp;6为P1片段62bp。
[0032] 图2为本发明实施例中第二次PCR产物电泳图。其中，1为DM标准分子量；3为 杂合抗菌肤CC34 12化P。
[0033]图3为本发明实施例中重组克隆质粒为模板PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，2 为杂合抗菌肤CC34 122bp;4为DNA标准分子量；5为阴性对照。
[0034]图4为本发明实施例中重组克隆质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1、5 为DNA标准分子量；2为杂合抗菌肤CC34 12化P;4 :阴性对照。
[0035] 图5为本发明实施例中重组表达载体的PCR鉴定。其中，4为重组载体CC34PCR 产物293bp。引物分别为：
[0036] F34 :5' -TTTGTCAGTTTGCCGATTAC-3'
[0037]R34 :5' -CTATTCCTAATAAGCCGATA-3'
[0038]图6为本发明实施例中重组质粒的酶切鉴定。其中，1为DNA标准分子量；2为重 组载体CC34酶切产物12化P。
[0039] 图7为本发明实施例中3条抗菌肤的化icine-SDS-PAGE分析。其中，1为空质粒 上清液；2为CC34样品上清液3. 7kDa;5为标准蛋白Marker。
【具体实施方式】
[0040] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，W下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于限定本发 明。 阳04U 实施例1 :
[0042] (1)构建表达载体：
[0043]a抗菌肤基因的合成及克隆载体的构建
[0044] 采用SOEingPCR技术来完成杂合抗菌肤CC34在体外的基因合成。抗菌肤设计如 下两对四条引物，每对都具有互补序列，经过两步PCR合成抗菌肤基因，并与pMD18-T克隆 载体相连，形成克隆重组质粒pMD18-T/CC34。
[0045] CC：M氨基酸序列：GWLKKIGKKIERVGQHT畑AILPIL化IGGLLGK
[0052] 采用SOEingPCR方法合成抗菌肤基因结果如图1、2,方法如下：
[0053] 第一次PCR时，F1与R1、F2与R2分别进行延伸，得到延伸液P1、P2、。反应体系 如下（WF1与R1为例）：
[0054]
阳化日]提前开起PCR仪预热，将上述试剂加入到PCR反应管中，混合均匀后瞬时离屯、，放 入PCR仪中。反应条件为：94°C预变性2min;30个循环（94°C变性30s，63°C退火30s，72°C 延伸30s) ;72°C终延伸2min。待反应结束，从中取5μΙ进行电泳检测（含有邸的1.5% 琼脂糖凝胶），剩余的部分暂-4Γ存放。
[0056] 第二次PCR时，W第一次PCR得到的相应延伸液（Ρ1与Ρ2)相互作为彼此的模板 和引物进行PCR，反应体系如下：
[0057]
[0058] 提前开起PCR仪预热，将上述试剂加入到PCR反应管中，混合均匀后瞬时离屯、，放 入PCR仪中。反应条件为：94°C预变性2min;30个循环（94°C变性30s，66°C退火30s，72°C 延伸30s) ;72°C终延伸5min。待PCR结束变得到CC34基因，用1.5%琼脂糖凝胶电泳对合 成的基因进行检测。
[0059]目的基因与克隆载体的连接： W60] 将抗菌肤基因与克隆载体PMD18-T载体