专利名称：双表达盒的表达载体及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及双表达盒的表达载体及其制备方法与应用。
些旦W 胃足汉不
哺乳动物细胞真核表达载体是基因工程技术中最常见的表达载体之一，被广泛 的应用于科研、生产等领域。与原核蛋白表达载体相比，由哺乳动物细胞翻译的蛋 白，经过翻译后的加工与修饰，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞 等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。目前在科研中真核蛋白表达质粒广为应用，
如研究蛋白在哺乳细胞中的定位、DNA疫苗的研制等，而且许多重要的蛋白及糖蛋 白利用哺乳动物细胞系统表达和生产，有些产品已投入临床应用或试用。
目前使用的真核表达蛋白质粒在构建表达外源基因质粒的过程中，是通过传统 的连接方法连接的，首先要选择合适的酶切位点，要求连接的外源基因片段中没有 所选择的酶切位点，然后用限制性内切酶酶切载体与外源基因片段，再用T4DNA连 接酶将载体与目的片段连接成一个完整的质粒。传统的这种酶切的连接方法存在步 骤比较烦琐、成本高(需要购买内切酶与连接酶)，连接效率较低等问题，在构建 过程中PCR产物与载体都要通过反复的酶切，电泳，回收等步骤，才能进行进一步 的连接
发明内容
本发明的目的是提供一种双表达盒的表达载体及其制备方法与应用。 本发明所提供的双表达盒的表达载体，命名为pDP-EX-vector,是一种环状载 体，包含原核复制起点、两个真核复制起点、筛选标记基因和两个外源基因表达盒； 所述两个外源基因表达盒分别为外源基因表达盒1和外源基因表达盒2;所述外源 基因表达盒l自上游至下游依次含有两个转录方向相同的启动子、连接片段l和多 聚腺苷酸加尾信号，所述连接片段l含有EcoRV识别序列；所述外源基因表达盒2 自上游至下游依次含有两个转录方向相同的启动子、连接片段2和多聚腺苷酸加尾 信号，所述连接片段2含有StuI识别序列。
其中，所述外源基因表达盒1和所述外源基因表达盒2的转录方向可以相同也 可以相反，优选所述外源基因表达盒1和所述外源基因表达盒2的转录方向相反。
4所述两个转录方向相同的启动子可为多种启动子，具体可为巨细胞病毒启动子
和T7噬菌体启动子。所述真核复制起点可为任何现已知的真核生物进行DNA复制 的起始点，具体可为SV40病毒复制起点。所述多聚腺苷酸加尾信号可为具有终止 转录作用的所有DNA片段，具体可为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。所述原 核复制起始位点可为任何现已知的原核生物进行DNA复制的起始点，具体可为大肠 杆菌质粒CoIEl复制起始位点。
pDP-EX-vector的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1。 用EcoRV或Stul酶切所述双表达盒的表达载体得到的线性载体也属于本发明 的保护范围。
本发明的另一个目的是提供所述双表达盒的表达载体的构建方法。 本发明所提供的双表达盒的表达载体的构建方法，包括如下步骤 1)以pEGFP-Nl质粒为模板，用如下引物5' ^^r677T7T7rCT6^rar7^C46^G
3'和5' fi^77r7^C^47^7<X7T(^6CATGCATCTAG 3'进行PCR扩增，得到片段A;
2 )以pCDNA3. 0质粒为模板，用如下引物5' C7r^6K4MM7TCAGCACAC
3'和5' OX7^7^(r"^TC^6^A^A4C^(;7 3'进行PCR扩增，得到片段B;
3) 将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和 片段B连接，获得重组载体I;
4) 以重组载体I为模板，用如下引物5' GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 禾Q 5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3，进行PCR扩增，得到片段D;
5) 以pEGFP-Nl质粒为模板，用如下引物
5， GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3，或5， CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC J， 进行PCR扩增，得到片段C;
6) 将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和 片段D连接，获得重组载体II;
7) 以pEGFP-Nl质粒为模板，用如下引物5， CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC 3，和5，
CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC J， 进行PCR扩增，得到片段F;
8) 以重组载体II为模板，用如下引物5' GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG 和5， GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG 3'进行PCR扩增，得到片段E;
9) 将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片段F连接，获得重组载体III;
10) 以重组载体III为模板用如下引物5'
CAATAATCAATGTCAACGCCTAGGCTTTTGCAGGA J，和5，
GGTGGGCTCTATGGCTTCCCTCCAAAAAAGCCTCCTC3， 进行PCR扩增，得到片段H;
11) 以PCDNA3. 0为模板，用如下引物5， GAGGAGGCTTTTTTGGAGG GAAGCCATAGAGCCCACCJ，与5' TCCTGCAAAAGCCTAGGCGTTGACATTGATTATTG3，进行PCR 扩增，得到片段G;
12)将片段G和片段H导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段G 和片段H连接，获得重组载体IV;
13) 以重组载体IV为模板，以引物如下
5, AAAGCAGGCCTTGTTTCTACTCTCGAGCATGCATCTJ，与5， AACAAGGCCTGCTTTCGCTGATATCTGCAGAATTC进行PCR扩增，得到片段I;
14) 将片段I导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组获得所述的载体。 本发明的pDP-EX-vector含有两个外源基因表达盒，每个表达盒都能表达蛋
白，可选择其中一个表达盒构建重组表达载体，也可同时使用两个表达盒构建重组 表达载体，两个表达盒中的外源基因可以相同也可以不同。
以本发明的pDP-EX-vector为出发载体，利用同源重组构建表达外源基因的重 组载体，避免了传统的酶切，连接等环节，整个构建过程中不使用任何内切酶与连 接酶，且比传统的连接过程省略了2-3个步骤，连接的效率也较理想。使用本发明 的pDP-EX-vector构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效， 可以快速完成大量外源基因的表达载体的构建。本发明的pDP-EX-vector含有两个 外源基因表达盒、两个真核复制起点，可以在i达T抗原的细胞中大量增值，从而 提高蛋白表达的水平，具有很好的应用前景。
图1为pDP-EX-vector的结构示意图。 图2为荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达结果。
具体实施例方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径 获得。
实施例1、 pDP-EX-vector的构建1) 重组载体I的构建
设计引物重组载体I (1)上游和重组载体I (1)下游、重组载体I (2)上游 和重组载体I (2)下游，引物的序列如下
重组载体I (1)上游5'^^7^77T7776r7^C^r6tT^^6^6 3'; 重组载体I (1)下游5'fi^77r7^^"7^70Ta^6CATGCATCTAG 3'。 重组载体I (2) 上游5' C7Tg赢超nd超r6CAGCACAC 3'(划线部分为 EcoR V酶识别位点)；
重组载体I (2) 下游5'ar7^7^r6^a^46^4^^i4C47^7 3'。
以pEGFP-Nl(Invitrogen)质粒为模板，用引物重组载体I (1)上游和重组载体
1(1)下游PCR扩增片段A，以pCDNA3.0质粒为模板，用引物重组载体I (2)上
游和重组载体I (2)下游PCR扩增片段B。
PCR反应体系10XPCR Buffer 5ML，上游、下游引物各1ML， DNA模板lpL，
MgCl2 (25raM) 3叱，dNTPs (各2. 5mM) 3ML， Pfu-Taq (5U/A) 0. 5!^L，最后补水至
反应条件94。C热变性5min; 94。C变性45s， 53。C退火45s， 72。C延伸6min， 共30个循环；72。C最后延伸10min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
50pl感受态细胞中加入片段A和B后混匀，片段A和B质量比为100 ng: 500 ng。混匀后体系冰浴30 min。 42。C水浴热激90秒，然后冰上放置3 min，加入预 热的LB培养基900 jil，置于37'C下，180 rpm振摇90 min，收集菌体，用LB液 体培养基重悬菌体，取200 jal重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37'C培养 12 h。挑取单克隆提取质粒，该质粒为重组载体I。
2) 重组载体II的构建
设计引物SV40 (1)上游和SV40 (1)下游、重组载体II上游和重组载体II下游， 引物SV40(1)上游和SV40(1)下游、重组载体II上游和重组载体II下游序列如下 SV40 (1)上游5， GTGCCACCTGACGTCCMAAGCCTAGGCCTCCJ，； SV40 (1)下游5， CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTCJ，。 重组载体II上游5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC3，； 重组载体II下游5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG3，。
以pEGFP-Nl质粒为模板，用引物SV40(1)上游和SV40(1)下游PCR扩增片段C;
7以重组载体I质粒为模板，用引物重组载体II上游和重组载体II下游PCR扩增片段D。
PCR反应体系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2 (25 mM) 3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3 HL， Pfu-Taq(5 U/叱)0.5叱，最后补 水至50叱。
反应条件94。C热变性5 min; 94。C变性45 s， 53 。C退火45s， 72 。C延伸6 min， 共30个循环；72 。C最后延伸10 min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
50pl感受态细胞中加入片段C和D后混匀，片段C和D质量比为100ng: 500ng。 混匀后体系冰浴30 min。 42"C水浴热激90秒，然后冰上放置3 min，加入预热的 LB培养基900 |il，置于37。C下，180rpm振摇90 min，收集菌体，用LB液体培养 基重悬菌体，取200 )al重悬液涂布LB板上(含有氨,青霉素)，37。C培养12h。 挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为重组载体II。
3)重组载体m的构建
设计引物SV40(2)上游和SV40(2)下游、重组载体III上游和重组载体III下游， 引物SV40(2)上游和SV40(2)下游、重组载体m上游和重组载体III下游序列如下 SV40(2)上游5， CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC3，； SV40(2)下游5， CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC3，。 重组载体III上游5， GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG3，； 重组载体III下游5， GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG3，。 以pEGFP-Nl质粒为模板，用引物SV40(2)上游和SV40(2)下游PCR扩增片段F; 以重组载体II质粒为模板，用引物重组载体III上游和重组载体III下游PCR扩增片段E。
PCR反应体系10XPCRBuffer5叱，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2(25 mM) 3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3叱，Pfu-Taq (5U/叱)0.5叱，最后补水 至50叱。
反应条件94 "C热变性5 min; 94 "变性45 s， 53 "C退火45 s， 72 。C延伸 6 min，共30个循环；72 。C最后延伸10 min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
50pl感受态细胞中加入片段E和F后混匀，片段E和F质量比为100ng: 500ng。混匀后体系冰浴30min。 42。C水浴热激90秒，然后冰上放置3rain，加入预热的LB 培养基900|11，置于37t:下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重 悬菌体，取200pl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37。C培养12h。挑取单 克隆提取质粒，该载体为重组载体III
4) 重组载体IV的构建
设计引物pCDNA上游和pCDNA下游、重组载体IV上游和重组载体IV下游，引物 序列如下
pCDNA上游5' GAGGAGGCTTTTTTGGAGGGAAGCCATAGAGCCCACCJ，； pC薩下游5， TCCTGCAAAAGCCTAGGCGTTGACATTGATTATTGJ'。 重组载体IV上游5， CAATAATCAATGTCAACGCCTAGGCTTTTGCAGGAJ，； 重组载体IV下游5， GGTGGGCTCTATGGCTTCCCTCCAAAAAAGCCTCCTCJ，。 以PCDNA3. 0质粒为模板，用引物pCDNA上游和pCDNA下游PCR扩增片段G;以
重组载体ni质粒为模板，用引物重组载体W上游和重组载体IV下游PCR扩增片段H。 PCR反应体系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1 ML， DNA模板1叱，
MgCl2(25 mM) 3叱，dNTPs (各2. 5 mM) 3叱，Pfu-Taq (5U/叱)0.5叱，最后补水
至50叱。
反应条件94 。C热变性5 min; 94 。C变性45 s， 53 。C退火45 s， 72 。C延伸 6 min，共30个循环；72 。C最后延伸10 min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
5(^1感受态细胞中加入片段G和H后混匀，片段G和H质量比为100ng: 500ng。 混匀后体系冰浴30min。 42'C水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB 培养基900pl，置于37t:下，180rpra振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重 悬菌体，取200pl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37。C培养12h。挑取单 克隆提取质粒，该载体为重组载体IV
5) pDP-EX-vector的构建
设计引物pDP-EX-vector上游和pDP-EX-vecto下游，引物序列如下 pDP-EX-vector上游AAAGCAGGCCTTGTTTCTACTCTCGAGCATGCATCT ; pDP-EX-vector下游AACAAGGCCTGCTTTCGCTGATATCTGCAGAATTC。 以重组载体IV质粒为模板，用引物pDP-EX-vector上游和pDP-EX-vector下游 PCR扩增片段I。PCR反应体系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1吣，DNA模板1叱， MgCl2(25 mM) 3礼，dNTPs(各2. 5 raM) 3 ML， Pfu-Taq(5U/叱)0.5叱，最后补水 至50叱。
反应条件94 t:热变性5 rain; 94 t)变性45 s， 53 'C退火45 s， 72 'C延伸 6 min，共30个循环；72 。C最后延伸10 min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
50|il感受态细胞中加入片段I后混匀。混匀后体系冰浴30min。 42。C水浴热激 90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900pl，置于37。C下，180rpm 振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200nl重悬液涂布LB板上 (含有氨苄青霉素)，37X:培养12h。挑取单克隆提取质粒，该载体为pDP-EXiector， PDP-EX-vector图谱如图1所示。
将pDP-EX-vector测序，测序结果表明，pDP-EX-vector的核苷酸序列如序列表 中的序列1，序列1自5'末端第1-629位为CMV启动子，自5'末端第630-648 位为T7启动子，自5'末端第713-718位为EcoR V酶的识别序列，自5'末端第 719-1071位为BGH Ploy A，，自5'末端第1072-1223位为SV40 Origin,自5' 末端第1224-1515为BGH Ploy A，自5'末端第1516-1521位为Stul酶切位点， 自5'末端第1522-1539位为T7启动子，自5'末端第1540-2261为CMV启动子， 自5'末端第2262-2880位为C0IE1 Origin,自5'末端第2881-4071位为氨节青 霉素抗性基因，自5'末端第4072-4239位为SV40 0rigin。序列1的自5'端第 700-715位的核苷酸序列和序列1的自5'端第716-730位的核苷酸序列为能与外源 基因上的PCR扩增产物发生同源序列重组的序列。序列1的自5'端第1504-1519 和序列1的自5'端第1520-1534能与外源基因上的PCR扩增产物发生同源序列重组 的序列。
实施例2、 pDP-EX-vector表达蛋白的能力 1)表达绿色荧光蛋白的pDP-EX-EGFPl的构建
设计引物EGFP (1)上游和EGFP (1)下游，引物EGFP (1)上游和EGFP (1) 下游序列如下
EGFP (1)上游WA4ntTGC4^4r TCGCCACCATGGTGAG;
EGFP (1)下游J7^C47^70Z46^r TTACTTGTACAGCTCG。
引物中GGAATTCTGCAGAT和ATGCATGCTCGAGGAT序列为能与序列1的自5'端第
10700-715位的核苷酸序列和序列1的自5'端第716-730位的核苷酸序列发生同源重 组的序列。
以pEGFP-Nl质粒为模板，用引物EGFP(1)上游和EGFP(1)下游PCR扩增EGFP1 基因片段。
反应体系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2(25 mM)3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3叱，Pfu-Taq (5U/叱)0.5 PL，最后补水 至50叱。
反应条件94 。C热变性5 rain; 94 。C变性45 s， 50 。C退火45 s， 72 。C延伸 1 min，共30个循环；72 。C最后延伸10 min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
pDP-EX-vector用EcorV内切酶酶切线性化，回收线性化的pDP-EX-vector。 酶切体系如下
10XDbufferl0pl， BSAlpl, EcoR V 2 y 1 (20U PROMEGA公司)，pDP-EX-vector 50ul，补水至100ul， 37° C酶切过夜。
酶切产物在1XTAE配制的琼脂糖凝胶中电泳，120v，电泳30分钟，DNA回收 试剂盒回收目的片段。
50|il感受态细胞中加入线性化的pDP-EX-vector和EGFP1基因片段后混匀，线 性化的pDP-EX-vector和EGFP1基因片段质量比为100ng: 500ng。混匀后体系冰浴 30min。 42。C水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900^1， 置于37。C下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200jil 重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37t:培养12h。挑取单克隆提取质粒，命 名为pDP-EX-EGFP1。
2)表达绿色荧光蛋白的pDP-EX-2EGFP的构建
设计引物EGFP (2)上游和EGFP (2)下游，引物EGFP (2)上游和EGFP (2) 下游序列如下
EGFP (2)上游TGAGTAGAAACAAGG TCGCCACCATGGTGAG;
EGFP (2)下游GAGAGCGAAAGCAGG TTACTTGTACAGCTCG。
引物中TGAGTAGAAACAAGG和GAGAGCGAAAGCAGG序列为能与序列1的自5'端第 1504-1519位的核苷酸序列和序列1的自5'端第1520-1534位的核苷酸序列发生同 源重组的序列。以pEGFP-Nl质粒为模板，用引物EGFP(2)上游和EGFP(2)下游PCR扩增EGFP2 基因片段。
反应体系10XPCR Buffer 5 ^L，上游、下游引物各1吣，DNA模板1叱， MgCl2(25 raM)3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3叱，Pfu-Taq(5U/nL) 0.5叱，最后补水 至50 1^L。
反应条件94 。C热变性5 min; 94 。C变性45 s， 50 。C退火45 s， 72 。C延伸 1 min，共30个循环；72 。C最后延伸10 min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
pDP-EX-EGFP用Stul内切酶酶切线性化，回收线性化的pDP-EX-EGFP。
酶切体系如下
10XD bufferlOfil， BSA l|ul， Stul 2 u 1 (20U PROMEGA公司)，pDP-EX-vector 50ul，补水至100ul， 37° C酶切过夜。
酶切产物在1XTAE配制的琼脂糖凝胶中电泳，120v，电泳30分钟，DNA回收 试剂盒回收目的片段。
50jul感受态细胞中加入线性化的pDP-EX-EGFP和EGFP2基因片段后混匀，线性 化的pDP-EX-EGFP和EGFP2基因片段质量比为100ng: 500ng。混匀后体系冰浴30min。 42t:水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900|al，置于37 。C下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取20(^1重悬 液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37。C培养12h。挑取单克隆提取质粒，命名为 pDP-EX-2EGFP。
3)绿色荧光蛋白的的检测
取10 ul lipof ectamine 2000 (Invitrogen公司)加入到250 ul的OPTI-MEMI 培养基(Invitrogen公司)中，室温放置5分钟，获得溶液1;将5ug pDP-EX-EGFP1， pDP-EX-2EGFP质粒分别加入到250 ul的OPTI-MEMI培养基中，获得溶液2和溶液 3;将溶液1和2混合，室温孵育20分钟，再加入500 ul的OPTI-MEMI培养基， 得到溶液4;将溶液1和3混合，室温孵育20分钟，再加入500 ul的OPTI-MEMI 培养基，得到溶液5。
将293T细胞置于6孔细胞板中培养，等待细胞长至60%时将细胞用PBS洗涤两 次，然后分别加入溶液4和溶液5， 37t;孵育5个小时，分别吸出溶液4和溶液5， 加入新鲜的OPTI-MEMI培养基，继续培养。培养24h后，在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。
以pEGFP-Nl质粒转染的293T细胞作为阳性对照，以转染pDP-EX-vector的 293T细胞作为阴性对照。
荧光显微镜结果如图2所示，pDP-EX-EGFP1转染后24小时293T细胞(图2C) 有荧光信号，pDP-EX-2EGFP转染后24小时293T细胞的荧光信号比pDP-EX-EGFPl 转染后24小时293T细胞的荧光信号强(图2C)，阳性对照也有荧光出现(图2B)， 而阴性对照(图2A)没有荧光。
上述实验结果说明，以pDP-EX-vector作为出发载体构建的重组表达载体，具 有良好的蛋白表达能力。序列表
<110> 中国农业大学
〈120〉双表达盒的表达载体及其制备方法与应用
<130> CGGNARW92031
<160> 1
<210> 1
<211〉 4239
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220> <223>
<400> 1
ac已ttg3tta^ttgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagccc60
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gcatgagtag aaacaaggcc tgctttcgct ctcgagggat atctgcagaa ttccagcaca 1560
ctggcggccg ttactagtgg atccgagctc ggtaccaagc ttgggtctcc ctatagtgag 1620
tcgtattaat ttcgataagc cagtaagcag tgggttctct agttagccag agagctctgc 1680
ttatatagac ctcccaccgt acacgcctac cgcccatttg cgtcaatggg gcggagttgt 1740
tacgacattt tgga犯gtcc cgttgatttt ggtgcc犯a^ ca犯ctccca "ttgacgtcaa 1800
tggggtggag acttggaaat ccccgtgagt caaaccgcta tccacgccca ttgatgtact 1860
gccaaaaccg catcaccatg gtaatagcga tgactaatac gtagatgtac tgccaagtag 1920
gaaagtccca t犯ggtcatg t￡tctgggcat aatgccaggc gggccWtta ccgtcattga 1980
cgtcaatagg gggcgtactt ggcatatgat acacttgatg tactgccaag tgggcagttt 2040
accgtaaata gtcc3cccat tgacgtcaat ggaaagtccc tattggcgtt actatgggaa 2100
catacgtcat tattgacgtc aatgggcggg gg"tcgttggg cggtcagcca ggcgggccat 2160
ttaccgtaag ttatgtaacg cggaactcca t.atatgggct atgaactaat gaccccgtaa 2220
ttgattacta ttaataacta gtcaataatc aatgtcaacg cctaggcttt tgcaggsaag 2280
aacatgtgeig ca^aaggccei gca^aeiggcc aggaaccgta犯aaggccgc gttgctggcg 2340
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 2400
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 2460
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 2520
agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 2580
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 2640
aactatcgtc t.tgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 2700
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta c卿gttctt gaagtggtgg 2760
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 2820
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 2880
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa etaggatctca agaagatcct 2940
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacga犯actcacgtta agggattttg 3000
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gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 3240<formula>formula see original document page 16</formula>
权利要求
1、一种环状载体，包含原核复制起点、两个真核复制起点、筛选标记基因和两个外源基因表达盒；所述两个外源基因表达盒分别为外源基因表达盒1和外源基因表达盒2；所述外源基因表达盒1自上游至下游依次含有两个转录方向相同的启动子、连接片段1和多聚腺苷酸加尾信号，所述连接片段1含有EcoRV识别序列；所述外源基因表达盒2自上游至下游依次含有两个转录方向相同的启动子、连接片段2和多聚腺苷酸加尾信号，所述连接片段2含有StuI识别序列。
2、 根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述外源基因表达盒1和所述外 源基因表达盒2的转录方向相反。
3、 根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于所述两个转录方向相同的启 动子为巨细胞病毒启动子和T7噬菌体启动子。
4、 根据权利要求3所述的载体，其特征在于所述真核复制起点为sv40病毒复 制起点。
5、 根据权利要求4所述的载体，其特征在于所述原核复制起始位点为大肠杆 菌质粒CoIEl复制起始位点。
6、 根据权利要求5所述的载体，其特征在于所述多聚腺苷酸加尾信号为牛生 长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。
7、 根据权利要求6所述的载体，其特征在于所述载体的核苷酸序列为序列表中的序列1。
8、 一种线性的载体，是用EcoRV或Stul酶切权利要求1至7中任一所述的载体 得到的线性载体。
9、 在表达sv40大t抗原的肿瘤细胞中，权利要求1至8中任一所述载体在表达 外源蛋白中的应用。
10、 权利要求7所述载体的构建方法，包括如下步骤1) 以pegfp-ni质粒为模板，用如下引物5':r677aT7ra^arc"x4(^"w 3'和5' fi^7T6T60WZ4rOTC6^6catgcatctag 3'进行pcr扩增，得到片段A;2) 以pCDNA3. 0质粒为模板，用如下引物5' 6TO席JM7TTgC扁M7TCAGCACAC 3'和5' OT7^Z^a^C6K^6^^fii4(^7^r 3'进行PCR扩增，得到片段B;3) 将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片 段B连接，获得重组载体I;4) 以重组载体I为模板，用如下引物5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 3，和5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG J'进行PCR扩增，得到片段D;5) 以pEGFP-Nl质粒为模板，用如下引物5， GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC ，或5' CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC < ' 进行PCR扩增，得到片段C;6) 将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片 段D连接，获得重组载体II;7) 以pEGFP-Nl质粒为模板，用如下引物5， CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC < ，和5， CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC ， 进行PCR扩增，得到片段F;8) 以重组载体II为模板，用如下引物5， GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG 和5' GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG 3'进行PCR扩增，得到片段E;9) 将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片 段F连接，获得重组载休m;10) 以重组载体m为模板用如下引物5'CAATAATCAATGTCAACGCCTAGGCTTTTGCAGGA ^和5， GGTGGGCTCTATGGCTTCCCTCCAAAAAAGCCTCCTC3， 进行PCR扩增，得到片段H;11) 以PCDNA3. 0为模板，用如下引物5， GAGGAGGCTTTTTTGGAGG GAAGCCATAGAGCCCACCJ，与5， TCCTGCAAAAGCCTAGGCGTTGACATTGATTATTG3'进行PCR扩 增，得到片段G;12) 将片段G和片段H导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段G和片 段H连接，获得重组载体IV;13) 以重组载体IV为模板，以引物如下5' AAAGCAGGCCTTGTTTCTACTCTCGAGCATGCATCTJ，与5' AACAAGGCCTGCTTTCGCTGATATCTGCAGAATTC进行PCR扩增，得到片段I;14) 将片段I导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组获得权利要求7所述的 载体。
全文摘要
本发明公开了一种双表达盒的表达载体及其制备方法与应用。该表达载体是一种环状载体，包含原核复制起点、两个真核复制起点、筛选标记基因和两个外源基因表达盒；所述两个外源基因表达盒分别为外源基因表达盒1和外源基因表达盒2；所述外源基因表达盒1自上游至下游依次含有两个转录方向相同的启动子、连接片段1和多聚腺苷酸加尾信号，所述连接片段1含有EcoRV识别序列；所述外源基因表达盒2自上游至下游依次含有两个转录方向相同的启动子、连接片段2和多聚腺苷酸加尾信号，所述连接片段2含有StuI识别序列。本发明的pDP-EX-vector含有两个外源基因表达盒、两个真核复制起点，可以在表达T抗原的细胞中大量增值，从而提高蛋白表达的水平，具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/63GK101463361SQ20091007638
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月14日 优先权日2009年1月14日
发明者傅光华, 刘芹防, 刘金华, 毕玉海, 娟 蒲, 马婧姣 申请人:中国农业大学