中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列、构建方法及其氨基酸序列和用途的制作方法

专利名称：中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列、构建方法及其氨基酸序列和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中国林蛙功能序列及其编码的蛋白序列，具体地说是一种中国林 蛙功能基因Rd-RNase2序列及其编码的氨基酸序列和其用途。
背景技术：
全世界每年新诊断的癌症病例达1亿，每10万人中250人死于癌症，因此战胜癌 症是现代医药最重大的挑战之一。尽管外科手术可以治愈可切除的癌症，不可切除的癌症 只能采用化学治疗或放射治疗。常规药物用于治疗存在的主要问题是，缺乏选择性，毒性强 烈及外来蛋白的免疫原性，经常会导致副反应，如暂时性腹泻、恶心、脱发、易感染。有时会 对心、肺、肾、骨髓产生长期影响。 大多数降解DNA的药物所导致的凋亡与野生型p53肿瘤遏制物的存在与否关系密 切，在p53缺失的情况下，降解DNA的药物对肿瘤无效。目前人类的大部分肿瘤(尤其是实 质性肿瘤)都能通过变异使p53失活，或产生p53抗体。而且，导致DNA损伤的药物往往能 够使正常细胞产生基因变异。 因此需要开发毒性适度的、人类具有免疫耐受性的药物来解决这些问题。 RNases能够降解RNA引起细胞死亡，被认为是一种毒素。活细胞大约含有20种外
切和内切核糖核酸酶，把RNA处理为成熟形式并调控RNA转录。RNase参与RNA代谢、细胞
成熟、细胞生理死亡、促进血管生成，而且发挥抵御RNA病毒的宿主防御功能。 当外源RNases进入细胞，它们可能通过降解RNA、削弱蛋白生物合成、引起凋亡而
杀死细胞。 实际上，已经发现多种核糖核酸酶在体外实验中具有细胞毒性，但在体内实验中 却毫无毒性。该家族的典型代表是牛胰腺核糖核酸酶(RNase A)，由于受到哺乳动物体内普 遍存在的核糖核酸酶抑制剂(RI)的作用，不具备抗肿瘤作用。而从牛精液中发现的天然二 聚体形式的核糖核酸酶(BS-RNase)，尽管与RNase A的氨基酸序列相似性高达80% ，但是 不受RI的抑制作用，在体内外实验中均显示出强大的选择性地抗肿瘤作用。BS-RNase不仅 作用于肿瘤细胞，还具有胚胎毒性，精子生成抑制，免疫抑制活性。EDN和ECP是来源于嗜酸 性粒细胞的核糖核酸酶A超家族成员，尽管序列相似，但是具有不同的功能。EDN具有抗病 毒功能，而ECP主要表现出强大的杀菌、杀寄生虫的功能。从家鸡(Gallus gallus)白细胞 中分离到两种核糖核酸酶RNases A-1和A-2，二者具有81 %氨基酸序列相同，二者都与人 血浆核糖核酸酶抑制剂(hRI)相互作用。RNases A_2同时具有血管生成活性和杀菌作用， RNases A_l没有这两种活性。目前的研究发现，核糖核酸酶A超家族成员是一组快速进化 的蛋白家族，不同的物种中核糖核酸酶序列的微小差异导致功能的显著变化。
目前文献报道的蛙类核糖核酸酶抗肿瘤的研究，仅局限于豹蛙、牛蛙和日本稻田 蛙。不同蛙物种核糖核酸酶的氨基酸序列不同，结构的差异导致功能不同。
在两栖动物蛙属中，最早被鉴定的核糖核酸酶是Onconase，是1991年Ardelt等从R. pipiens卵中基于其抗肿瘤作用而分离的蛋白。0nconase完整氨基酸顺序的阐明，揭 示出其属于核糖核酸酶A超家族。另外三种核糖核酸酶从蛙的卵和肝被鉴定牛蛙Rana catesbeiana(娃卵rc—RNase，娃肝rc—Ll)日本禾舀田娃Ranajaponica (娃卵rj—lec)。 1998年Huang等首先分离出编码蛙核糖核酸酶的cDNA，发现mRNA仅在雌蛙的肝脏表达， 最终合成的蛋白定位于蛙卵细胞中。2000年Liao等从蛙卵黄颗粒提取物和肝中分离出 5个编码牛蛙R. catesbeiana核糖核酸酶的cDNA序列(rc-01编码rc-Ll， rc_02， rc_03， rc-04， rc-06) ，2000年Chen等从R. pipiens中发现了性别特异性的细胞毒性核糖核酸酶 (rp-rap) 。 2001年Rosenberg等以牛蛙Rana catesbeiana基因组DNA为模板，采用PCR得 到了五个新的蛙核糖核酸酶基因顺序(rc-203， rc-204， rc-208， rc_212， rc-218)。表明来 源于蛙属的核糖核酸酶基因通过正向选择快速分化的方式进化，暗示了这个独特的蛋白家 族可能具有新的生理功能。 以核糖核酸酶A为代表的大多数嘧啶碱基特异性核糖核酸酶具有四个分子内的 二硫键，而且其位置非常保守。蛙蛋白保留了核糖核酸酶A四个二硫键中的三个，在靠近C 端出现一个新的二硫键。尽管与RNase A具有相似的三维结构，来源于两栖动物的RNases 在体外实验中不受人RI抑制，这归因于其与RNase A的序列相似性低。进化地位更低的鱼 类却受到RI抑制。 从豹蛙中分离出的核糖核酸酶Onconase是通过内化进入细胞引起细胞毒性。已 经发现Onconase能减小动物体内肿瘤的大小，能增强几种化学治疗剂的细胞毒功效。但 是，Onconase还具有胚胎毒性，抑制精子生成、免疫抑制活性及肾毒性。Onconase作为治疗 不能手术的恶性间皮瘤的抗肿瘤药进入临床三期实验。 从日本稻田蛙的卵中分离出一种具有凝集活性的核糖核酸酶jSBL，可优先凝集大 量的各种人类和动物的肿瘤细胞，而不是正常的红细胞，淋巴细胞，或成纤维细胞。从牛蛙 卵中也分离出具有凝集各种肿瘤细胞作用的核糖核酸酶cSBL。具有凝集活性的核糖核酸酶 可识别大量的各种肿瘤细胞的细胞表面糖蛋白特征的具体组织结构和方向，这无疑对于人 类癌症提供了 一个重要的基础诊断和治疗。 cSBL和jSBL蛋白对体内的多种癌细胞均表现出细胞毒性，其中cSBL已被证明是 一种在体外也非常有效用的化疗药物。在一项有关的实验研究中，研究人员将肿瘤细胞注 入小鼠腹膜内腔，24小时后开始每天按一定剂量对其中部分小鼠进行治疗。研究结果表明， 被治疗小鼠的存活时间显著高于未被治疗小鼠的存活时间。 对cSBL进行的研究显示，cSBL的酶活性不受人类RNase酶抑制因子的抑制，它们 一旦进入细胞中，其降解肿瘤细胞RNA、杀死癌细胞的作用能很好地发挥，有利于作为抗癌 药物应用。 蛙具有独特的嘧啶碱基特异性的核糖核酸酶，结构相似于乌龟、蜥蜴、鸡的核糖核 酸酶。但是来源于蜥蜴的核糖核酸酶没有发现细胞毒性。尽管进行了大量的研究，然而，并 非所有的实验结果都一致。抗肿瘤主要问题免疫原性、细胞毒性的选择性、稳定性。

发明内容
本发明的目的在于补充现有技术的不足而提出一种中国林蛙Onconase样功能基 因Rd-RNase2序列。
本发明另一目的在于提出一种上述中国林蛙Onconase样功能基因Rd-RNase2序 列的构建方法。 本发明的又一目的在于提出上述中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的氨基酸序 列及由该氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的且与该氨基酸序列功能相同 的氨基酸衍生序列。 本发明的再一目的在于提出一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的用途。
为实现上述目的，本发明的发明思路为 Onconase的抗肿瘤作用机制是基于其内化进入肿瘤细胞，降解RNA，抑制蛋白质 的合成，诱导肿瘤细胞凋亡。处于对数生长期的细胞在Onconase药物作用24h后，细胞 增殖停止，而对处于停滞期的细胞没有作用。这可能与细胞识别有关，在药物作用剂量下， Onconase只作用于肿瘤细胞，而对正常生长细胞没有影响。除了与化学药物不同的作用靶 点外，提高肿瘤细胞氧压、使抗性细胞恢复对药物的敏感性是Onconase使实体瘤减小的另 一因素，也是与其它药物协同作用的原因。在实体瘤中，细胞间流体压力的增大往往导致抗 肿瘤药物的输送障碍0nconase诱导肿瘤微血管压力升高，血液流动加快，使肿瘤血管氧 化压力显著增高。因此它可能成为新的放射增强剂，关于它辐射反应的体内研究已获得许 可。本发明从中国林蛙的基因组中克隆编码Onconase样核糖核酸酶成熟蛋白的基因，找到 具有Onconase样抗肿瘤活性的核糖核酸酶，作为制备治疗肿瘤生物药物的应用。本发明是 以中国林蛙DNA中制备一种新的Onconase样基因序列Rd-RNase2，以其为基础作为制备新 型、高效的抗肿瘤功能生物药物的应用，具有重要的医药开发应用价值。
本发明采用的具体技术方案为 —种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列，其为序列表中SEQ ID No. 1所示的核苷 酸序列，具体如下成熟蛋白编码区基因序列C皿g3Ctgg3皿3C3tttC3 g^g^gC3C ctgac^^gcccgggatat60^tetcatgt ca^^cctt gttc^ctgc ^3gac3c^acacttttatcttttcactt120cctgggccag ttaaggccct ctgtagagga attaaagtctgttaagtcgt180tcagagtttg atctctctga gtgcaatgta aaatccaagccctgcaagta240■■■agtg 3tgg33tttg teteacatgt agggatg^gctccggtecattttgtcggt300gtcgg皿gtt gc312一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列氨基酸序列，其为序列表中SEQ IDNo.2所
示的氨基酸序列，具体如下由基因序列推导得到成熟蛋白编码区蛋白序列Gin Asp Trp Lys Thr Phe Gin Lys LysHisLeuThrLysAlaArgAsp1 51015lie Lys Cys Asp Asn lie Met Ser LysThrLeuPheAsnCysLysAsp20 2530Thr Asn Thr Phe lie Phe Ser Leu ProGlyProValLysAlaLeuCys35 4045Arg Gly lie Lys Val Ser Lys Asn ValLeuSerArgSerGluPheAsp
50 55 60 Leu Ser Glu Cys Asn Val Lys Ser Lys Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys
65 70 75 80 Lys Lys Ser Asp Gly lie Cys lie Thr Cys Arg Asp Glu Ala Pro Val
85 90 95 His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列氨基酸序列的衍生序列，其是由序 列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的且与序列 表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。 上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法，其具体步骤为提取 出中国林蛙的基因组DNA，设计基因特异性引物，进行PCR扩增，产物电泳，所述的基因特异 性引物为序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列，为正反引物对
正向引物N275 :TAT TTG CAG TTG TTT TGA GTC TCA C
反向引物C715 :CTG CTT ATC ACA TCC CTG TTG TC 从电泳胶中回收目标DNA片段，与质粒连接，转移到细胞，提取质粒，PCR初步鉴定 目标基因后，测序。 上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列氨基酸序列的构建方法，其中，所 述PCR反应体系及参数 基因组模板100ng、d證s(10mM) 1 ii L、10XTaq Buffer 5 ii 1、Taq DNAPolymerase 3U和引物(N275， C715)各30pmol、补无菌超纯水至总体积为50iU，混合均匀;
扩增条件为94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s， 35个循环，72。C延伸7min结束。
上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列氨基酸序列的构建方法，其中，所 述与质粒连接的具体步骤为 (1)目标DNA片断(20ng) 、 pGM-T载体(50ng) 、 T4 DNA Ligase 3U、10XT4DNA
Ligase Buffer 1 iU，补无菌超纯水至总体积10 iU ; (2) 16t:连接10 12小时制备成连接好载体的基因； (3)对步骤(2)连接好的样品进行PCR检测；连接产物1 yl、 dNTPs (10mM) 1 y L、 lOXTaq Buffer 5 ii 1、Taq DNA Polymerase 3U和质粒通用引物(T7，SP6)各10pmol，补无 菌超纯水至总体积50iU，混合均匀；PCR扩增条件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35个循 环，72t:延伸7min结束； (4)2. 5% TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测，紫外分析仪中，观察DNA条带。 上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列构建方法，其中，所述转移到细胞
的具体步骤为 (1)将5 ill (50ng)目标基因与质粒连接的产物(重组质粒pGM-RNase2)加入到
100 ii 1感受态细胞DH5 a中，混匀，冰浴30min ; (2) 42"水浴中热激90s ;取出后立即置于冰浴2min ; (3)加入500iil提前37t:预热好的不含抗生素的LB培养基中，37t:，150rpm摇床 培养45min ;
(4)4000rpm离心2min，弃部分上清液，浓縮后取100 yl涂转化平板，涂匀，干燥， 倒置平板，37t:恒温箱培养12 16h ; (5)挑取分离良好、中等大小的白色菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中， 摇床37°C 、 180rpm培养12 16h。 上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法中，所述提取质粒PCR 鉴定的PCR反应体系及参数为 提取的重组质粒(pGM-RNase2) 1 ii 1、 dNTPs (10mM) 0. 5 ii L、 10 X Taq Buf f er2 ii 1、 Taq DNA Polymerase 1. 5U和质粒通用引物(T7， SP6)各5pmo1，补无菌超纯水至总体积 20iU，混合均匀;PCR扩增条件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35个循环，72。C延伸7min结束。
—种所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的扩增引物，为序列表中SEQ IDNo. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列，为正反引物对。 上述中国林蛙上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列在制备治疗抗肿瘤 药物中的应用。 本发明的优点与效益 本发明首先提取中国林蛙的基因组DNA，设计特异性引物，PCR扩增基因，测定基 因顺序。经过数据库检索，确定为中国林蛙核糖核酸酶新基因。 本发明林蛙功能基因Rd-RNase2序列经核糖核酸酶介导的肿瘤细胞凝集和对肿 瘤细胞的选择性杀伤作用与野生型p53肿瘤遏制物的存在与否无关，并且该基因的稳定性 较之现有技术更好。该基因表达研究显示该基因编码的蛋白质具有细胞毒性，能抑制肿瘤 细胞的生长，符合制备抗肿瘤药物的条件。在抑瘤实验中可以看出，本发明Rd-RNase2基因 重组融合蛋白在极低浓度下对肿瘤细胞具有很强大的杀伤作用，但对正常细胞无杀伤性， 因此在制备抗肿瘤药物方面较之现有基因药物存在很大的优势。并且重组蛋白Rd-RNase2 具有很好的抗氧化功能，这是其对肿瘤细胞抗增殖、细胞毒活性的重要影响因素。因为细胞 的氧化还原状态影响细胞功能的各个方面。许多药物的细胞毒效果是由活性氧调节的。氧 化应激可以干扰癌症化学药物治疗，包括阿霉素等化学治疗药物引起Burkitt淋巴瘤细胞 凋亡可以被过氧化氢酶抑制。重组蛋白Rd-RNase2在肿瘤治疗方面具有很好的功效，并且 其在与氧化应激有关的病理条件，如炎症、自身免疫疾病、动脉粥样硬化、败血症休克、肌萎 縮性(脊髓)侧索硬化等疾病的治疗方面具有应用的潜能。 本发明中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建对进一步研究RNases有很大的 启示性作用。氨基酸序列与现有序列的差异显著，功能性更强，可作为一种有选择性的细胞 毒素，具有重要的医药开发应用价值。 下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整 体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以 实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于 对本发明的侵犯。


图1为目的基因PCR扩增结果 图2为载体连接检测结果图； 图3为转移到细胞的转化结果图； 图4为质粒PCR扩增检测结果图； 图5为空载体诱导表达对宿主菌生长无影响图； 图6为Rd-RNase2经IPIG诱导表达后对宿主菌生长有抑制作用图； 图7为大肠杆菌裂解液的SDS-PAGE图； 图8为SDS-PAGE检测亲和胶纯化后重组蛋白的纯度图； 图9为大肠杆菌裂解液总蛋白与纯化的重组蛋白Western blotting检测图； 图10为重组融合蛋白对C6胶质细胞瘤细胞和对CH0-K1细胞的生长抑制作用图； 图11重组蛋白Rd-RNase2对小鼠肝组织丙二醛含量的影响。
具体实施例方式
本发明具体实施方式
所用材料及设备来源 1、实验动物中国林蛙(Rana dybowskii)来源吉林省桦甸市；选择标准识别特 征皮色多为深褐色，肚黄色，嘴端略钝圆，耳膜边有羊角黑瘢，颈背处有〃 A〃形黑斑，四 肢有环行黑斑。 2、所用菌种和载体大肠杆菌感受态细胞DH5 a ， pGM_T载体(均购于TIANGEN生
物技术有限公司)。 3、工具酶与生化试剂 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，硅胶膜型PCR产物(DNA片断)纯化试剂盒，普通质 粒小提试剂盒，Tryptone， Yeast Extract, Agarose,氨苄青霉素，X_Gal， IPTG等(均购于 TIANGEN生物技术有限公司)，dNTPs，T4DNA Ligase，入DNA/HindIII， Taq DNA Polymerase, EcoR I， HindIII， lkb DNA Ladder, DNA Marker I (均购于TaKaRa公司)，基因组DNA提取 试剂盒、核酸染料GoldView，50bp DNALadder(购于北京赛百盛生物技术有限公司)，其它
试剂均为市售分析纯。 4、设备和器材 TGL-16C型台式离心机，上海安亭科学仪器厂； HQ-60型旋涡混合器，北方同正生物技术发展公司； PCR扩增仪9700型，Gene Amp公司； THZ-D型台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂； UV-IV型紫外分析仪，北京市新科技应用研究所； SPN202F型电子天平，梅特勒-托利多称重设备系统有限公司； DYY-6C型电泳仪北京市六一仪器厂； DYCP-31DN型电泳槽，北京六一仪器厂； LRH-250型生化培养箱，上海一恒科技有限公司； LS-835L型立式压力蒸汽灭菌锅江阴江滨医疗设备厂； SWCJ-B型净化工作台，天津市中环实验电炉有限公司； DZKW型电子恒温水浴锅，光明牌。 实施例1 :本发明中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的具体构建方法
1、引物设计
基因特异性引物 正向引物N275 :TAT TTG CAG TTG TTT TGA GTC TCA C
反向引物C715 :CTG CTT ATC ACA TCC CTG TTG TC
2、目标基因的PCR扩增 (1)使用血液基因组提取试剂盒，从林蛙新鲜血液中提取基因组DNA，1X琼脂糖 电泳检测分子量及浓度。 (2)向无菌PCR管中加入基因组模板100ng、 dNTPs(10mM) 1 ii L、10XTaq Buffer5ii 1、Taq DNA Polymerase 3U和引物(N275，C715)各30pmol、补无菌超纯水至总体 积为50iU，混合均匀； (3)将加入样品的PCR管放入已经预热好的PCR仪中进行PCR反应。PCR扩增条 件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s， 35个循环，72。C延伸7min结束。 (4) PCR结束后，在2. 5 % TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测并切胶纯化目标基因。紫 外分析仪中，观察DNA条带。 经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳如图1所示，以Marker I为参照标准，在紫外分析 仪中，可看到约在400bp位置(包括部分信号序列，准确值为387bp)出现明亮的荧光条带， 证明目的基因扩增成功，可用于接下来的载体连接。
3、pGM-T载体连接 (1)向无菌PCR管中加入目标基因片断(20ng) 、 pGM-T载体(50ng) 、 T4DNALigase 3U、10XT4DNA Ligase Buffer 1 ii l，补无菌超纯水至总体积10 ii 1 ;
(2)16t:连接10 12小时制备成连接好目标基因的载体； (3)对连接好的样品进行PCR检测。向无菌PCR管中加入连接产物liU、 dNTPs(10mM) 1 ii L、10XTaq Buffer 5iU、Taq DNA Polymerase3U和质粒通用引物(T7， SP6)各10pmol，补无菌超纯水至总体积50iil，混合均匀。 (4)将加入样品的PCR管放入已经预热好的PCR仪中进行PCR反应。PCR扩增条 件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35个循环，72。C延伸7min结束。 (5)PCR结束后，在2.5X TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测。紫外分析仪中，观察 DNA条带。 对16t:连接过夜的结果进行PCR及琼脂糖电泳检测如图2所示，在紫外分析仪中，
以Marker I为参照标准，可看到在600bp位置出现明亮的荧光条带，与预期结果基本一致，
证明载体连接成功，可进行后续实验。 4、制备转化平板 (1)配制LB及LB/Agar培养基 ①LB液体培养基配制(500ml) :Tryptone 5g、 Yeast Extract 2. 5g、 NaCl 5g， 加入400ml水，充分搅拌溶解，滴加5N NaOH(约0. 2ml)，调pH值到7. 0，再加水定容至 500ml(取出200ml用于配制固体培养基，300ml分装两瓶，各150ml) 。 121°C，0. lMPa，高压 灭菌20min。 4。C存放。 ②LB/Agar/Amp固体培养基配制按LB液体培养基准备好，高压灭菌前加入 Agar 3g/200ml，高压灭菌，冷却至50 6(TC，在超净台上向其中加入抗生素(氨苄青霉素)0. 2ml，混匀，倒平板(20ml/板)，4。C存放。 (2)在超净台上，向铺好含有相应抗生素的LB/Agar/Amp固体培养基表面加入
16iU IPTG(50mg/ml)、40ii1 X-Gal (20mg/ml)，使用无菌涂棒涂匀，避光37。C恒温箱中放
置1 3小时后使用。 5 、转化感受态细胞DH5 a (1)5iil(50ng)连接产物加入到100 iU感受态细胞中，混匀，冰浴30min。 [ono] (2)42。C水浴中热激90s。取出后立即置于冰浴2min。 (3)加入500iil提前37t:预热好的LB培养基(不含抗生素)，37°C ， 150rpm摇床 培养45min。 (4)4000rpm离心2min，弃部分上清液，浓縮后取100 yl涂转化平板，涂匀，干燥， 倒置平板，37t:恒温箱培养16h。 转化结果如图3所示，16h培养后，经连接、转化的目的基因在培养基上长出蓝色
和白色两种菌落，其中白色菌落为所需目的菌，在经过菌落检测后，若结果正确，则可用于
液体培养及质粒提取。 6、提取质粒、扩增及测序 (1)挑取分离良好、中等大小的白色菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中， 摇床37°C 、 180rpm培养12h。 (2)用质粒提取试剂盒提取质粒。用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测质粒。 (3)PCR检测重组质粒中的插入DNA片段。向无菌PCR管中加入提取的重组质粒
(pGM-RNase2) 1 ii 1 、 d證s (10mM) 0. 5 ii L、 10 X Taq Buffer 2 ii 1 、 Taq DNAPolymerase 1. 5U
和质粒通用引物(T7，SP6)各5pmol，补无菌超纯水至总体积20iil，混合均匀。PCR扩增条
件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s， 35个循环，72。C延伸7min结束。2. 5%琼脂糖凝胶检测。
至总体积20iU，混合均匀。 PCR扩增检测质粒上目标基因片段插入如图4所示，经12h培养所得菌液进行质 粒提取，对所得质粒进行PCR反应及琼脂糖电泳检测，以Marker I为参照标准，可看到在 600bp位置出现明亮的荧光条带，与预期结果基本一致，证明质粒提取结果正确。
(4)将提取的质粒测序。 质粒样品由北京三博远志生物技术有限责任公司测序。得到成熟蛋白编码区基因 序列为SEQ ID No. 1所示，具体为 c朋gactgg3朋3C3tttca g朋g33gcac ctg3C33朋g cccgggatet te朋tgtgat 60
aatatcatgt caaaaacctt gttcaactgc aaagacacaa acacttttat cttttcactt 120
cctgggccag ttaaggccct ctgtagagga attaaagtct ccaaaaatgt gttaagtcgt 180
tcagagtttg atctctctga gtgcaatgta aaatccaagc cctgcaagta taaattaaag 240
3朋朋朋gtg atgg朋tttg tet朋catgt 3gggatg朋g ctccggteca ttttgtcggt 300
gtcggaagtt gc 312
由基因序列推导得到成熟蛋白编码区蛋白序列如SEQ ID No. 2所示，具体为
Gin Asp Trp Lys Thr Phe Gin Lys Lys His Leu Thr Lys Ala Arg Asp
15 10 15 lie Lys Cys Asp Asn lie Met Ser Lys Thr Leu Phe Asn Cys Lys Asp
20 25 Thr Asn Thr Phe lie Phe Ser Leu Pro Gly
35 40 Arg Gly lie Lys Val Ser Lys Asn Val Leu
50 55 Leu Ser Glu Cys Asn Val Lys Ser Lys Pro
65 70
Lys Lys Ser Asp Gly lie Cys lie Thr Cys
85 90 His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100
将上述测序结果与Genbank数据库进行序列比对，结果表明，本发明所述的中国 林蛙功能基因Rd-RNase2序列为新的基因。 实施例2 :本发明构建的中国林功能基因Rd-RNase2序列及氨基酸序列的生物学 实验 —、材料和方法 1、材料 (1)菌种和载体 大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞购于TIANGEN生物技术有限公司，pFLAG-CTS载
体购于sigma-aldrich。 (2)工具酶与生化试剂 Tryptone，Yeast Extract, Agarose,氨节青霉素，X-Gal， IPTG等(均购于TIANGEN 生物技术有限公司)，其它试剂均为市售分析纯。
(3)设备和器材
设备 THZ-D型台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂； SPN202F型电子天平，梅特勒-托利多称重设备系统有限公司； LRH-250型生化培养箱，上海一恒科技有限公司； LS-835L型立式压力蒸汽灭菌锅江阴江滨医疗设备厂； SWCJ-B型净化工作台，天津市中环实验电炉有限公司； 2、实验方法 将携带有空质粒pFLAG-CTS或携带有中国林蛙Rd-RNase2基因的重组质粒 pFLAG-RNase2的大肠杆菌BL21 (DE3)涂布于LB/agar/Amp平板上活化，挑取LB/agar/Amp 平板上过夜生长的单菌落，接种于20ml LB/Amp培养基中，37t:，180rpm摇菌过夜。次日在 20ml菌液中再加入新鲜LB/Amp培养基20ml， 37°C ， 180rpm摇菌至对数生长中期(0D6。。= 0. 8)，分出20ml菌液于已灭菌并预热至37t:的三角瓶中，加入终浓度为20uM的IPTG诱导 表达，剩余的20ml菌液中不加IPTG，作为非诱导对照，定时检测0D6。。，记录IPTG诱导重组 蛋白表达过程中对宿主菌生长的抑制情况。
3、实验结果
30
Pro Val Lys Ala Leu Cys 45
Ser Arg Ser Glu Phe Asp 60
Cys Lys Tyr Lys Leu Lys 75 80 Arg Asp Glu Ala Pro Val 95
(1)空载体诱导表达对宿主菌生长无影响，如图5所示，用20uM IPTG诱导携带有 空质粒pFLAG-CTS的Escherichia Coli BL21(DE3)表达后，宿主菌的生长情况与未诱导相 比，没有差别。可见空载体的诱导表达不影响宿主菌的生长。 (2)重组质粒pFLAG-RNase2诱导表达过程中对宿主菌生长具有明显抑制作用，如 图6所示，用20uM IPTG诱导携带有重组质粒pFLAG-RNase2的EscherichiaColi BL21 (DE3) 表达重组蛋白30min后，明显可见宿主菌的生长受到抑制，60min后抑制率达到19%，诱导 120min后抑制率可达到64% 。
4、结论 携带有本发明所述抗肿瘤功能基因Rd-RNase3的重组质粒pFLAG-RNase2的大肠 杆菌BL21 (DE3)，在加入诱导剂IPTG以后开始转录和表达Rd-RNase2基因，重组蛋白分泌至 大肠杆菌的周质腔中储存。 实验结果表明，诱导剂IPTG对带有空载体的大肠杆菌没有抑制作用，说明空载体 本身的诱导表达对大肠杆菌没有细胞毒作用。 诱导剂IPTG对带有Rd-RNase2重组质粒pFLAG-RNase2的大肠杆菌具有显著的抑 制作用，说明重组蛋白的诱导表达对大肠杆菌具有显著的细胞毒作用。尤其值得注意的是 携带有pFLAG-CTS质粒的宿主菌都是耐受Amp抗生素的耐药菌，说明了重组蛋白的细胞毒 性较强，这些重组蛋白有可能在治疗耐药病原菌引起的感染性疾病方面具有应用价值，同 样也说明了这些重组蛋白在治疗肿瘤细胞中具有应用价值。 实施例3 :本发明中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的重组融合蛋白的制备
—、材料与设备
1、菌种和载体 大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞购于TIANGEN生物技术有限公司，pFLAG-CTS载 体购于sigma-aldrich。
2、工具酶与生化试剂 Tryptone，Yeast Extract, Agarose,氨节青霉素，X-Gal， IPTG等(均购于TIANGEN 生物技术有限公司)，小鼠抗FLAG单克隆抗体(购于Sigma公司)，连接有碱性磷酸酶的羊 抗小鼠二抗，BCIP/NBT显色试剂盒(购于北京中杉金桥生物公司)，其它试剂均为市售分析纯。 3、设备 THZ-D型台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂； LRH-250型生化培养箱，上海一恒科技有限公司； LS-835L型立式压力蒸汽灭菌锅江阴江滨医疗设备厂； 超净工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司； YC-1层析柜，北京博医康实验仪器有限公司； 高速冷冻离心机(SORVALL RC6PLUS) ， THERMO ; 冷冻干燥机(FD-1B-50)，北京亚泰科隆实验科技开发中心； 超声波细胞粉碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司； 万分之一电子天平(AR2140)，奥豪斯公司； ra仪(rasj-3F)，上海雷磁
可见-紫外分光光度计(UV-1700) ， SHIMADZU ; 垂直电泳槽(DYC2-24D)，北京六一仪器厂； 电泳仪(DYY-8C)，北京六一仪器厂 二、实验方法 1 、菌体的培养及超声裂解 将携带重组质粒的菌体，在LB/Agar/Amp培养基的平板上划线，37。C恒温箱中培 养过夜。次日用接种针挑取分离良好的单菌落，接入LB/Amp液体培养基中，置于摇床，于 37°C， 180rpm，培养12小时。按照5%接种量接种于预热好的LB/Amp培养基中，共培养6L 菌液。使菌生长至对数期(0D600 = 0. 6 0. 8)时加入终浓度为20uM的IPTG诱导4h。
离心收集菌体，PBS洗涤三次。加入破碎缓冲液，冰浴超声，裂解菌体。离心收集 上清液。分离胶浓度为12%的SDS-PAGE及western blot检测裂解液中的目标蛋白。
2、亲和胶纯化重组融合蛋白 在重组蛋白的C端带有FLAG标签(其氨基酸序列为EFPGTRSVDYKDDDDK) ， FLAG不 会影响目标蛋白质正确折叠成三维结构，也不会影响目标蛋白质的活性。可方便地利用小 鼠抗FLAG单克隆抗体偶联的琼脂糖亲和胶(购于sigma公司)进行纯化。具体方法是将 细胞裂解液高速冷冻离心(4°C，20000rpm，30min)后，取上清，与亲和胶孵育，4°C ，过夜。离 心(4°C ， 1500rpm， 2min)，收集亲和胶。用TBS洗胶，五次。向亲和胶中加入lml甘氨酸洗脱 液，轻摇lmin，离心(4。C，1500rpm，2min)，取上清，放入一支有lOul中和液的离心管内，分 批共洗脱亲和胶5次，收集5管洗脱蛋白。
3、检测样品纯度 将得到的洗脱蛋白合并，对水充分透析后冻干。将冻干粉用100ul TBS溶解后，用 Bradford法测定蛋白质浓度，进行SDS-PAGE，检测产品纯度，westernblotting鉴定重组蛋 白。 三、实验结果 1 、大肠杆菌裂解液中重组融合蛋白的检测 携带有Rd-RNase2基因的重组质粒pFLAG-RNase2的大肠杆菌在LB/Amp培养基 中培养至对数中后期(0D600 = 0. 6 0. 8)，加入终浓度为20uM的IPTG诱导4h后，离心 收集菌体，洗涤菌体后冰浴超声裂解细胞，将得到的裂解液进行SDS-PAGE(分离胶浓度为 12% )，检测到裂解液中在预期分子量位置有重组融合蛋白的条带。如图7所示，为大肠杆 菌裂解液的SDS-PAGE图，图中最左边泳道为大肠杆菌裂解液，中间泳道为核糖核酸酶A， 最右侧为低分子量蛋白标准。由图可见，在分子量约13.7kDa处有目标蛋白表达。
2、亲和胶纯化重组融合蛋白Rd-RNase2 将细胞裂解液高速冷冻离心(4°C ， 20000rpm， 30min)后，取上清，与连接有抗FLAG 抗体的亲和胶一起孵育过夜，使目标蛋白吸附于亲和胶上。经过多次洗涤亲和胶去除杂蛋 白后，采用分部酸洗脱，使目标蛋白Rd-RNase2从亲和胶上解析下来。洗脱后的Rd-RNase2 重组蛋白立即用中和液中和至中性pH值。电泳检测重组蛋白Rd-RNase2的纯度。结果如图 8示，为SDS-PAGE检测亲和胶纯化后重组蛋白的纯度图，由图可见，在分子量约为13. 7kDa 处重组蛋白为均一条带。采用亲和胶纯化得到了重组蛋白的单一组分。
分别将大肠杆菌裂解液和纯化的重组蛋白经12%分离胶浓度的SDS-PAGE分离后，转印到PVDF膜上，分别用抗FLAG小鼠单克隆抗体(Sigma， 300倍稀释)、二抗——碱 性磷酸酶连接的羊抗小鼠抗体(中杉金桥生物公司，20倍稀释)与抗原反应，BCIP/NBT 显色鉴定重组蛋白，如图9所示，为大肠杆菌裂解液总蛋白与纯化的重组蛋白Western
blotting检测图，泳道1 :大肠杆菌裂解液总蛋白；泳道2 :纯化的重组蛋白。图中，左边为
大肠杆菌裂解液，右边为Rd-RNase2纯品。由此可鉴定大肠杆菌裂解液总蛋白中有重组蛋 白表达，经过亲和胶纯化后得到了重组蛋白的纯品。
4、结论 本实验将导入重组质粒的大肠杆菌进行培养，制备核糖核酸酶Rd-RNase2重组融 合蛋白。由于核糖核酸酶为胞内酶，首先进行细胞破碎，上清液即为粗酶液。采用亲和胶 分离纯化，得到林蛙Rd-RNase2重组融合蛋白，SDS-PAGE电泳检测到分子量约在13. 7kDa 左右的均一条带。Western blotting法鉴定了 Rd-RNase2重组融合蛋白。建立了有效的 Rd-RNase2重组融合蛋白的制备方法。 实施例4 :中国林蛙Rd-RNase2基因的重组融合蛋白的体外抗肿瘤作用研究 —、材料与设备 1 、细胞株、培养基与生化试剂 大鼠C6胶质瘤细胞株购自哈尔滨医科大学神经微生物系，中国仓鼠卵巢CH0-K1 细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。DMEM高糖型培养液、RPMI1640培养基购于 Gibco，小牛血清、青霉素、链霉素、MTT、台盼蓝、DMS0购于鼎国生物技术有限公司，其它试剂
均为市售分析纯。
2、设备 二氧化碳培养箱(日本Forma); 酶标仪(Lab systems Dragon well scan MK3); 倒置显微镜(Nikon 808434); 立式压力蒸汽灭菌锅(LS-835L型)江阴江滨医疗设备厂；
净化工作台(SWCJ-B型)，上海新苗医疗器械制造有限公司。
二、实验方法
1、细胞培养 C6胶质细胞瘤细胞和中国仓鼠卵巢CH0-K1细胞分别生长于DMEM高糖型培养液和 RPMI 1640培养液(Gibco公司)，内含体积分数为10%小牛血清(56。C灭活30min) 、100U/ ml青霉素、100ii g/ml链霉素，于37t:、体积分数为5% C02的培养箱中培养，每2 3d传 代一次，取对数生长期细胞用于实验。 2、 MTT实验检测重组融合蛋白Rd-RNase2对细胞生长的抑制作用
收集对数生长期细胞，用0. 25%胰酶消化，配制成细胞悬液，于显微镜下用血球计 数板计数，调整细胞初始浓度为1X104细胞/ml。于96孔培养板内每孔接种lOOiU(每 孔含1000个细胞)。培养24h后，吸出培养液，按实验设计分别加入含不同药物浓度的培 养液，用培养基配制重组融合蛋白Rd-RNase2，设5个浓度50 y g/l、25 y g/1、12. 5 y g/1、 6. 25ii g/1、3. 12ii g/1，空白对照组加入不含药物的等体积培养液，每组设3个平行孔，每 孔加样100 iU。置37t:、体积分数为5% C02孵育箱中培养48h后弃去培养液，用培养液洗 2次，以去除药液，每孔加入0. 5% MTT溶液(RPMI 1640配制)20 yl。 37。C保温4h，弃上清液，每孔加入DMSO 200 ii 1溶解Formazan颗粒，平板振荡仪振荡10min，在酶标仪上490nm
波长检测各孔吸光度值，绘制细胞存活率曲线。 三、实验结果 1、 MTT实验检测重组融合蛋白对细胞的生长抑制作用，实验结果如图10所示，为 重组融合蛋白对C6胶质细胞瘤细胞和中国仓鼠卵巢CH0-K1细胞的生长抑制作用图，由图 可见，重组融合蛋白对C6胶质细胞瘤细胞的生长具有显著抑制作用，对CH0-K1细胞无抑制 作用。 四、结论 胶质瘤列于中枢神经系统中致死性肿瘤的首位，从诊断到死亡的平均时间仅为1
年，现行的治疗方法难以收到满意的疗效，因此寻找对抗胶质瘤的药物迫在眉睫。 重组融合蛋白在极低浓度下对于受试的C6胶质细胞瘤细胞具有强大的体外细胞
毒性，且呈现明显的剂量依赖效应。对CH0-K1细胞无抑制作用。可见，重组融合蛋白具有
选择性杀伤肿瘤细胞的细胞毒性。对于肿瘤的临床治疗具有重要的开发应用价值。 实施例5 :中国林蛙Rd-RNase2基因的重组融合蛋白抗氧化作用 —、材料与设备 1、实验动物与试剂 ICR小鼠，体重18 22g，雌雄兼用。北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
硫代巴比妥酸、三氯乙酸、硫酸亚铁、过氧化氢等试剂均为市售分析纯。
2、设备 万分之一电子天平(AR2140)，奥豪斯公司；
高速冷冻离心机(S0RVALL RC6PLUS) ， THERMO ;
TGL-16C型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；
DZKW型电子恒温水浴锅，光明牌。
可见-紫外分光光度计(UV-1700) ， SHIMADZU ;
二、实验方法 检测重组蛋白对小鼠肝微粒体脂质过氧化产物丙二醛的作用。 1、肝匀浆液的制备取小鼠肝脏，用冷生理盐水洗净后称重，冰浴下匀浆，制成
0. 5%悬浮液，离心(4。C，5000rpm，20min)后取上清液用于抗氧化性测定。 硫代巴比妥酸法脂质过氧化反应的最终产物丙二醛在酸性条件下与硫代巴比妥
酸共热(IO(TC ， 20min)，生成粉红色物质，于532nm有吸收峰，可计算出丙二醛的量，从而得
出脂质过氧化的情况。 2、小鼠肝组织丙二醛含量的测定各取肝匀浆液lml，加不同浓度的重组蛋白 lml，加入6mmol/L的FeS04100ii 1，最后加入60mmol/L H20240 ii 1，37。C水浴孵育lh后，加 入lml 15%三氯乙酸结束反应，再加入lml 6. 7X硫代巴比妥酸，于沸水浴中显色20min， 冷却后离心，取上清于532nm处测定吸光度值。
数据处理结果经t检验。
三、实验结果 由图11可知，由于Fe2++H202体系生成的 OH具有极强的损坏性，导致小鼠肝微 粒体脂质过氧化产物丙二醛含量增加，加入重组蛋白Rd-RNase2后，丙二醛产生的量减少，
16说明重组蛋白Rd-RNase2能够抑制Fe2++H202体系生成的 0H，从而抑制肝微粒体脂质过
氧化反应的进行。 四、结论 细胞的氧化还原状态影响细胞功能的各个方面。许多药物的细胞毒效果是由活性 氧调节的。氧化应激可以干扰癌症化学药物治疗，包括阿霉素等化学治疗药物引起Burkitt 淋巴瘤细胞凋亡可以被过氧化氢酶抑制。重组蛋白Rd-RNase2具有抗氧化功能，这可能是 其对肿瘤细胞抗增殖、细胞毒活性的重要因素。重组蛋白Rd-RNase2可能在肿瘤治疗以及 与氧化应激有关的病理条件，如炎症、自身免疫疾病、动脉粥样硬化、败血症休克、肌萎縮性 (脊髓)侧索硬化等疾病的治疗方面具有应用的潜能。
序列表 〈110〉北京联合大学生物化学工程学院 〈120〉中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列、构建方法及其氨基酸序列和用途
〈130〉
〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 5
〈210>1
〈211>312
〈212>DNA 〈213〉中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列
〈400〉 1 c朋gactgg3朋3C3tttca g朋g33gcac ctg3C33朋g
aatatcatgt caaaaacctt gttcaactgc aaagacacaa
cctgggccag ttaaggccct ctgtagagga attaaagtct
tcagagtttg atctctctga gtgcaatgta aaatccaagc
3朋朋朋gtg atgg朋tttg tet朋catgt 3gggatg朋g
gtcggaagtt gc
〈210>2
〈211>104
〈212>PRT 〈213〉中国林蛙功能基因Rd-RNase2氨基酸序列
〈400>2 Gin Asp Trp Lys Thr Phe Gin Lys Lys His Leu
1 5 10 lie Lys Cys Asp Asn lie Met Ser Lys Thr Leu
20 25 Thr Asn Thr Phe lie Phe Ser Leu Pro Gly Pro
35 40 Arg Gly lie Lys Val Ser Lys Asn Val Leu Ser
50 55
cccgggatat taaatgtgat 60 acacttttat cttttcactt 120 ccaaaaatgt gttaagtcgt 180 cctgc朋gte te朋tte朋g 240 ctccggtaca ttttgtcggt 300
312
Thr Lys Ala Arg Asp 15
Phe Asn Cys Lys Asp 30
Val Lys Ala Leu Cys 45
Arg Ser Glu Phe Asp 60
Leu Ser Glu Cys Asn Val Lys Ser Lys Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys 65 70 75 80 Lys Lys Ser Asp Gly lie Cys lie Thr Cys Arg Asp Glu Ala Pro Val 85 90 95 His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys 100 〈210>3 〈211 〉25 〈212〉DNA 〈213〉正向引物N275 〈400>3 tatttgcagt tgttttgagt ctcac 25 〈210〉4 〈211 〉23 〈212〉DNA 〈213〉反向引物C715 〈400〉4 ctgcttatca catccctgtt gtc 2权利要求
一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列，其特征在于，为序列表中SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
2. —种中国林蛙功能基因Rd-RNase2氨基酸序列，其特征在于，为序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3. —种权利要求2所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2氨基酸序列的衍生序列，其特 征在于，其是由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或 添加一个或几个氨 基酸的且与序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法，其特征在于， 其具体步骤为提取出中国林蛙的基因组DNA，设计基因特异性引物，进行PCR扩增，产物电 泳；所述的基因特异性引物为序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列，为 正反引物对正向引物N275 :TAT TTG CAG TTG TTT TGA GTC TCA C 反向引物C715 :CTG CTT ATC ACA TCC CTG TTG TC从电泳胶中回收目标DNA片段，与质粒连接，转移到细胞，提取质粒，PCR初步鉴定目标 基因后，测序。
5. 根据权利要求4所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法，其特征在于， 所述PCR反应体系及参数基因组DNA、dNTPs、H20、10XTaq Buffer、Taq DNA Polymerase和基因特异性引物至总 体积50iU，混合均匀；扩增条件为94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35个循环，72。C延伸7min结束。
6. 根据权利要求4所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法，其特征在于， 其特征在于，所述与质粒连接的具体步骤为(1) 目标DNA片断、载体、T4DNA Ligase、10XT4 DNA Ligase Buffer至总体积10 ii 1 ;(2) 16t:连接10 12小时制备成连接好目标基因的载体；(3) 对步骤(2)连接好的样品进行PCR检测；连接产物liU、 dNTPs、10XTaqBuffer 5ii 1、Taq DNA Polymerase3U和质粒通用引物各lOpmol，补无菌超纯水至总体积50 ii l，混 合均匀；PCR扩增条件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35个循环，72。C延伸7min结束;(4) 2. 5% TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测，紫外分析仪中，观察DNA条带。
7. 根据权利要求4所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法，其特征在于， 其特征在于，所述转移到细胞的具体步骤为(1) 将5iU目标基因与质粒连接的产物加入到lOOiU感受态细胞中，混匀，冰浴 30min ;(2) 42t:水浴中热激90s ;取出后立即置于冰浴2min ;(3) 加入500 ii 1提前37t:预热好的不含抗生素的LB培养基，37°C， 150rpm摇床培养 45min ;(4) 4000rpm离心2min，弃部分上清液，浓縮后取100 yl涂转化平板，涂匀，干燥，倒置 平板，37t:恒温箱培养16h;(5) 挑取分离良好、中等大小的白色菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，摇床 37。C、180rpm培养12h。
8. 根据权利要求4所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法，其特征在于， 其特征在于，所述提取质粒PCR鉴定的PCR反应体系及参数为提取的重组质粒、dNTPs、10XTaq Buffer、 H20、 Taq DNA Polymerase和引物至总体积 20iU，混合均匀;PCR扩增条件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s， 35个循环，72。C延伸7min结束。
9. 一种权利要求l所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的扩增引物，其特征在于， 为序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列，为正反引物对。
10. —种中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种中国林蛙Onconase样功能基因Rd-RNase2序列，其为序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明首先提取中国林蛙的基因组DNA，设计特异性引物，PCR扩增基因，测定基因顺序。经过数据库检索，确定为新的基因，即本发明所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列。经实验表明，本发明所述中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的蛋白有在治疗耐药病原菌引起的感染性疾病方面具有应用价值，且本发明所述重组蛋白在制备治疗肿瘤细胞的生物药物中具有广泛的应用价值。
文档编号C12N15/55GK101775400SQ20091007636
公开日2010年7月14日 申请日期2009年1月14日 优先权日2009年1月14日
发明者赵伟, 陶凤云 申请人:北京联合大学生物化学工程学院